基于原位反應(yīng)性頂空系統(tǒng)對(duì)金花清感顆粒揮發(fā)油抗氧化活性研究

丁崗芯，尹金芳，崔恩浩，鄒 維，石 峰，趙建松，熊華斌，楊 志，高云濤, 2*

基于原位反應(yīng)性頂空系統(tǒng)對(duì)金花清感顆粒揮發(fā)油抗氧化活性研究

丁崗芯1，尹金芳1，崔恩浩1，鄒 維1，石 峰1，趙建松3，熊華斌1，楊 志1，高云濤1, 2*

1. 云南民族大學(xué)，云南 昆明 650500 2. 云南民族大學(xué) 云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國(guó)際聯(lián)合研究中心，云南 昆明 650500 3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410000

設(shè)計(jì)一種反應(yīng)性頂空系統(tǒng)，包括輔助加熱裝置和內(nèi)插式反應(yīng)池的反應(yīng)性頂空瓶，用于中藥中揮發(fā)油抗氧化活性研究，建立揮發(fā)油抗氧化活性評(píng)估方法。輔助加熱裝置加熱反應(yīng)性頂空瓶底部，紅外熱成像儀研究反應(yīng)性頂空瓶溫度分布；揮發(fā)油進(jìn)入頂空并與內(nèi)插式反應(yīng)池中自由基發(fā)生清除反應(yīng)，分光光度法測(cè)定自由基吸光度變化；固相微萃取針從頂空反應(yīng)池上方原位取樣，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）測(cè)定頂空揮發(fā)油清除反應(yīng)前后成分變化，表征抗氧化活性成分。改進(jìn)的金屬浴輔助加熱裝置實(shí)現(xiàn)樣品區(qū)及頂空溫差大于50 ℃，使揮發(fā)油快速釋放進(jìn)入頂空的同時(shí)避免自由基熱分解；金花清感顆粒（Jinhua Qinggan Granules，JQG）用量為1.50 g，樣品溫度90 ℃，反應(yīng)30 min時(shí)，對(duì)2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)［2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS］自由基清除率達(dá)88.95%（＝6，RSD＝1.91%）；建立的抗氧化活性評(píng)估方法的精密度和重復(fù)性RSD（＝8）分別為2.50%、1.24%；經(jīng)GC-MS分析鑒定出57種揮發(fā)油，包括蒎烯、青蒿酮等，其中清除反應(yīng)前后峰面積減少達(dá)到30%以上的有35種，占總揮發(fā)性油的61.40%，據(jù)此推斷具有抗氧化活性的成分主要為萜類和醛酮、酚酸等化合物，主要包括羅勒烯、α-細(xì)辛腦等。JQG揮發(fā)油具有良好的抗氧化活性；設(shè)計(jì)制作的反應(yīng)性頂空系統(tǒng)可在一個(gè)小型密閉反應(yīng)瓶中原位一步完成揮發(fā)油的釋放-清除自由基-頂空微萃取進(jìn)樣3個(gè)過程；建立的方法具有快速、高效、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可用于中藥揮發(fā)油的抗氧化活性評(píng)估以及活性成分鑒定。

反應(yīng)性頂空系統(tǒng)；固相微萃取；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；金花清感顆粒；揮發(fā)油；抗氧化活性；自由基；蒎烯；青蒿酮；萜類；醛酮；酚酸；羅勒烯；α-細(xì)辛腦

在芳香類中藥中，其揮發(fā)性成分或揮發(fā)油可減少氧化損傷[1]，具有良好的抗氧化作用[2-3]。新冠肺炎患者呼吸窘迫、肺部纖維化、器官衰竭等病癥與炎癥風(fēng)暴息息相關(guān)[4]，而炎癥風(fēng)暴可使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基，進(jìn)一步誘發(fā)氧化損傷[5-6]，因此在治療新冠肺炎患者時(shí)，通過中藥揮發(fā)油清除病毒感染產(chǎn)生的自由基[7]以及抗氧化輔助性治療[8-9]能夠有效減輕患者的不適癥狀。

新冠肺炎在中醫(yī)學(xué)中屬于疫病范疇[10]，病因?yàn)楦惺堋耙哽濉敝畾猓∥辉诜危静C(jī)特點(diǎn)為“濕、熱、毒、瘀”。芳香類中藥具有清熱解毒、辟除穢濁、扶助正氣的功效[11]，金花清感顆粒（Jinhua Qinggan Granules，JQG）屬于芳香類中藥，它由麻杏石甘湯和銀翹散加減而成，麻杏石甘湯中麻黃、杏仁、石膏、甘草具有辛涼宣泄、清肺平喘的作用，銀翹散的主要功效是辛涼透表、清熱解毒[12]。在我國(guó)新冠肺炎爆發(fā)流行后，JQG被列為治療新冠肺炎推薦用藥之一[13]，它在改善臨床癥狀、減少轉(zhuǎn)重率、提升免疫能力等方面具有較好的療效[14-17]，其作用機(jī)制[18-19]、活性成分[20]以及潛在藥效[21]也受到關(guān)注。但在治療中，藥品一般為口服，經(jīng)食道吸收后達(dá)到清除自由基的作用，所以對(duì)其揮發(fā)油經(jīng)呼吸道吸入后清除自由基的研究甚少。古人將芳香類中藥研磨成粉、裝于香囊、佩于胸前，用于驅(qū)除瘟疫[22]，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，將霧化、芳香治療等吸入式療法用于輔助治療新冠肺炎中、重癥患者[23-24]，因此，研究JQG揮發(fā)性油氣體狀態(tài)下清除自由基能力和抗氧化成分，可為JQG在新冠肺炎病程中的治療作用和機(jī)制提供參考，也可為篩選吸入式療法藥品提供方法。

揮發(fā)油抗氧化的研究一般分為2個(gè)過程，首先采用水蒸氣蒸餾、有機(jī)溶劑[25-27]等方式對(duì)樣品中揮發(fā)油進(jìn)行提取，再通過提取液的自由基清除反應(yīng)和成分變化來評(píng)價(jià)其抗氧化性，但傳統(tǒng)方式獲得的提取液含有高沸點(diǎn)或難揮發(fā)的成分，并不能真實(shí)反映出樣品中揮發(fā)油本身對(duì)自由基清除的作用，制約了揮發(fā)油的抗氧化活性研究。頂空-固相微萃取是研究揮發(fā)油的重要方法，主要用于樣品色譜進(jìn)樣前處理[28]，不能對(duì)揮發(fā)油的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建一種原位反應(yīng)性頂空系統(tǒng)，建立對(duì)揮發(fā)油抗氧化成分從釋放-萃取-反應(yīng)一體化的方法，可應(yīng)用于研究揮發(fā)油清除自由基能力的評(píng)估和抗氧化成分的表征，實(shí)現(xiàn)原位、快速和高效對(duì)揮發(fā)油抗氧化活性的評(píng)價(jià)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)研究了JQG揮發(fā)油對(duì)2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)［2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS］自由基的清除和其抗氧化活性成分分析，以此作為評(píng)價(jià)JQG揮發(fā)油抗氧化活性的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Fisher ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；50/30 μm DVB/CAR/ PDMS，57328-U型固相微萃取纖維頭，美國(guó)Supelco公司；TESTO 869紅外熱成像儀，北京時(shí)代創(chuàng)科科技有限公司；TU1950型紫外-可見分光光度計(jì)，上海普析光學(xué)分析儀器公司；20 mL鉗口頂空瓶、瓶蓋、聚四氟乙烯硅膠墊片，湖州立榮儀器有限公司。

1.2 試藥

JQG，聚協(xié)昌（北京）藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)200501；ABTS，美國(guó)Sigma公司；過硫酸鉀（AR），優(yōu)耐德引發(fā)劑（上海）公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 原位反應(yīng)性頂空方法

2.1.1 原位反應(yīng)性頂空系統(tǒng)設(shè)計(jì) 反應(yīng)性頂空系統(tǒng)包括原位頂空反應(yīng)瓶和輔助加熱裝置2部分，原位頂空反應(yīng)瓶如圖1所示，包括瓶體和內(nèi)插式反應(yīng)池2個(gè)部分。瓶體由普通頂空瓶、復(fù)合墊片及瓶鉗口蓋3部分組成，主要作用為承載樣品和保存樣品揮發(fā)性成分；內(nèi)插式反應(yīng)池部件從上至下由鉗口掛柱、1 mL反應(yīng)池組成，掛柱負(fù)責(zé)連接瓶蓋和反應(yīng)池。使用時(shí)，將待測(cè)樣品置于頂空瓶底部，反應(yīng)池置于樣品上方的頂空；使用壓蓋器將瓶蓋、復(fù)合墊片和掛柱密閉壓緊于瓶口上，再將反應(yīng)性頂空瓶置于輔助加熱裝置中；樣品預(yù)熱3 min，用微量進(jìn)樣針吸取一定體積的ABTS自由基溶液后刺穿頂空瓶蓋的復(fù)合墊片，將吸取的自由基溶液注入反應(yīng)池中，繼續(xù)加熱反應(yīng)一定時(shí)間；用微量進(jìn)樣針吸取出反應(yīng)后的自由基溶液，采用分光光度計(jì)在734 nm處測(cè)定吸光度（樣品），同時(shí)測(cè)定空白樣的吸光度（空白），依據(jù)下式計(jì)算的樣品揮發(fā)油對(duì)自由基的清除率[3]。

自由基清除率＝(空白－樣品)/空白

圖1 頂空反應(yīng)瓶的實(shí)物圖(a)、結(jié)構(gòu)示意圖(b) 和反應(yīng)池的結(jié)構(gòu)示意圖(c)

在清除反應(yīng)過程中，將固相微萃取纖維頭刺穿墊片并置于反應(yīng)池上方頂空，分別萃取清除反應(yīng)前和清除反應(yīng)后的揮發(fā)油成分，以研究反應(yīng)前后揮發(fā)油成分的變化。

2.1.2 輔助加熱裝置及性能測(cè)試 本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)性頂空系統(tǒng)的輔助加熱裝置主要用于加熱頂空反應(yīng)瓶底部的待測(cè)樣品，使其快速升溫所需溫度，以保證揮發(fā)油從待測(cè)樣品基質(zhì)中釋放并進(jìn)入頂空與反應(yīng)池中自由基發(fā)生清除反應(yīng)。經(jīng)過ABTS自由基穩(wěn)定性試驗(yàn)，當(dāng)自由基溶液溫度高于40 ℃時(shí)，30 min時(shí)的自由基分解達(dá)到10%以上，誤差較大，而低于40 ℃，30 min時(shí)自由基分解約為3%，可滿足測(cè)定要求，因此，在整個(gè)加熱過程中，同一個(gè)頂空瓶的底部和頂空需保持“上冷下熱”，形成足夠的溫差。

基于此，本實(shí)驗(yàn)為金屬浴加熱器設(shè)計(jì)了特制的加熱模塊，采用紅外熱成像分析了其加熱過程中，底部樣品和頂空上部反應(yīng)池溫度分布及變化，并與盤式加熱裝置、水浴加熱裝置進(jìn)行比較。溫度設(shè)定在90 ℃，加熱5 min，3種加熱方式下的頂空瓶溫度分布如圖2所示，改進(jìn)的金屬浴加熱器主要對(duì)樣品多方向聚焦式加熱，加熱5 min能夠?qū)⒌撞繕悠窚囟燃訜岬?0 ℃，整個(gè)過程，頂部溫度低于38 ℃，形成較大的溫差（?＞50 ℃），保證樣品揮發(fā)油釋放，同時(shí)滿足自由基溶液穩(wěn)定存在的溫度條件，還能同時(shí)處理24個(gè)樣品，而水浴加熱和盤式加熱不僅不能精準(zhǔn)的控溫，它們頂空的溫度大于45 ℃，不能達(dá)到樣品揮發(fā)油釋放和自由基穩(wěn)定存在的溫差。

2.2 影響ABTS自由基清除反應(yīng)的因素

2.2.1 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)清除率的影響 選擇JQG作為樣品，先考察了反應(yīng)溫度對(duì)自由基清除率的影響，結(jié)果如表1所示。當(dāng)樣品加入量為1.50 g，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，在75～90 ℃，隨著樣品區(qū)溫度的升高，清除率增大，然而溫度超過90 ℃后，清除率隨之減小。從誤差棒可以看出，樣品區(qū)溫度低于75 ℃時(shí)，RSD值較高，到了80 ℃，RSD值明顯下降，這是因?yàn)闃悠穮^(qū)溫度低于80 ℃，樣品揮發(fā)油未能充分的釋放，說明該過程受溫度影響較大，同時(shí)也說明該反應(yīng)的速率大小受樣品加熱溫度的控制。在90 ℃時(shí)，揮發(fā)油已穩(wěn)定充分從樣品基質(zhì)中釋放，進(jìn)入了頂空，并較好的與反應(yīng)池中自由基溶液完成清除反應(yīng)，但是當(dāng)樣品區(qū)溫度超過90 ℃，頂空溫度也超過了40 ℃，導(dǎo)致頂空反應(yīng)池中自由基溶液不穩(wěn)定，發(fā)生熱分解，因此根據(jù)清除率和RSD值，本實(shí)驗(yàn)選擇90 ℃為樣品加熱溫度。

反應(yīng)時(shí)間對(duì)清除率的影響如表2所示。根據(jù)表2，JQG對(duì)ABTS的清除率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增大，30 min后趨于平穩(wěn)，在30 min時(shí)，清除率最高，持續(xù)加熱30 min以上，自由基清除率RSD值開始明顯增加，這是因?yàn)榧訜針悠窢顟B(tài)下，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，內(nèi)插式反應(yīng)池中放置ABTS自由基溶液逐漸穩(wěn)定性變差，導(dǎo)致精密度下降所致，因此，選擇30 min為反應(yīng)的最佳時(shí)間。

表1 反應(yīng)溫度對(duì)自由基清除率的影響

Table 1 Effect of reaction temperature on scavenging radical

溫度/℃清除率/%RSD/%溫度/℃清除率/%RSD/% 7540.0044.059089.112.71 8050.927.679587.984.84 8585.875.25

表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)自由基清除率的影響

Table 2 Effect of reaction time on scavenging radical

時(shí)間/min清除率/%RSD/%時(shí)間/min清除率/%RSD/% 513.5313.462583.444.07 1032.0313.193088.762.52 1548.747.683589.575.44 2071.204.854089.0212.46

2.2.2 樣品用量對(duì)清除率的影響 進(jìn)一步研究了樣品用量對(duì)清除率的影響，如表3所示。隨著樣品加入量的增加，清除率增大，在1.50 g時(shí)清除率達(dá)到最高值；當(dāng)樣品加入量大于1.50 g時(shí)，隨之減小。

觀察圖3可知，在0.50～2.50 g，由于頂空瓶的直徑一定，樣品加入的質(zhì)量越大，在頂空瓶中堆積高度也越高，堆積高度過高會(huì)導(dǎo)致底部樣品的揮發(fā)油不能完全充分釋放，使反應(yīng)受到影響，清除效果減弱，因此JQG最佳加入量為1.50 g。

表3 樣品用量對(duì)自由基清除率的影響

Table 3 Effect of dosage on scavenging radical

樣品用量/g清除率/%RSD/%樣品用量/g清除率/%RSD/% 0.5072.5020.102.0085.752.92 1.0087.992.862.5083.321.86 1.5089.062.25

圖3 JQG不同用量的堆積高度圖

2.3 方法學(xué)考察

用“2.1”項(xiàng)中方法對(duì)反應(yīng)性頂空系統(tǒng)的方法學(xué)進(jìn)行了考察。在精密度試驗(yàn)中，批量稱取8份JQG，每份1.50 g，測(cè)定和計(jì)算得到其揮發(fā)油對(duì)ABTS自由基溶液的清除率在85.32%～92.33%，RSD為2.50%；在重復(fù)性試驗(yàn)中，連續(xù)8 d測(cè)定了JQG揮發(fā)油與ABTS自由基溶液反應(yīng)后ABTS的吸光度（）值，并其對(duì)ABTS自由基的清除率和RSD值，清除率在84.13%～92.77%，RSD在0.10%～3.81%。精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)表明反應(yīng)性頂空系統(tǒng)的精密度和重復(fù)性良好，符合測(cè)定分析測(cè)定要求。

2.4 JQG揮發(fā)油抗氧化成分分析

利用SPME-GC/MS對(duì)JQG中的總揮發(fā)油進(jìn)行測(cè)定和分析，再用同樣的方法對(duì)JQG清除自由基后的揮發(fā)油進(jìn)行測(cè)定，分析JQG揮發(fā)油抗氧化活性成分。經(jīng)GC-MS計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中的NIST 11譜庫(kù)檢索、CAS號(hào)查詢、參考文獻(xiàn)報(bào)道[29-30]中JQG中部分化學(xué)成分等進(jìn)行匹配定性，確定其中化合物名稱并按照萜類化合物和非萜類化合物分類如表4所示。

對(duì)JQG的總揮發(fā)油統(tǒng)計(jì)及定性分析，總共有57種化合物，其中萜類化合物有21種，非萜類化合物有36種（包括脂肪烴6種，醇類2種，醛酮類有7種，酚酸類7種，酯類6種，其他化合物8種）。再對(duì)JQG清除ABTS自由基后所剩揮發(fā)油的比較和分析，得到具有抗氧化性的揮發(fā)油，共有35種化合物，萜類化合物有17種，包括α-崖柏烯、羅勒烯、樅油烯、γ-松油烯、δ-4-蒈烯、異蒲勒醇、薄荷醇、α-松油醇、4-氯異龍腦、-薄荷酮、異胡薄荷酮、胡椒酮、6-甲基-3-異丙基-2-羥基環(huán)己-2-烯-1-酮、3-甲基-6-異丙基-2-羥基環(huán)己-2-烯-1酮、α-可巴烯、石竹烯、庫(kù)貝醇。

表4 JQG揮發(fā)油清除自由基前后成分對(duì)比

Table 4 Comparison of components of JQG before and after removal of volatile oil

編號(hào)tR/min名稱相對(duì)減少率/%分類編號(hào)tR/min名稱相對(duì)減少率/%分類 13.31α-崖柏烯70.32單萜烯306.22青蒿酮?醛酮類 23.48α-蒎烯? 316.90苯乙酮80.37 34.18羅勒烯100.00 3218.112-甲基-4-羥基苯乙酮47.90 44.34β-蒎烯? 3319.14茉莉酮? 55.51樅油烯52.13 3420.631,13-十四二烯-3-酮100.00 66.32γ-松油烯56.36 3521.80瓜菊醇酮100.00 77.21δ-4-蒈烯52.83 3628.01α-細(xì)辛腦100.00 85.85順式對(duì)薄荷-1(7),8-二烯-2醇?單萜醇3723.19丹皮酚100.00酚酸類 97.87異蒲勒醇53.11 3823.49甲基丁香酚? 1011.17薄荷醇52.15 3924.772,6-二叔丁基-4-甲酚? 1111.93α-松油醇47.85 4025.102,4-二叔丁基苯酚34.60 1223.924-氯異龍腦100.00 4131.93肉豆蔻酸? 1310.07L-薄荷酮53.18單萜酮4234.31青蒿酸? 1413.98異胡薄荷酮65.51 4337.01棕櫚油酸100.00 1514.83胡椒酮57.89 4410.75E-2-苯甲酸乙烯酯76.53酯類 1615.246-甲基-3-異丙基-2-羥基環(huán)100.00 4516.41乙酸薄荷酯41.36 己-2-烯-1-酮 4619.77異戊酸香葉酯 1717.043-甲基-6-異丙基-2-羥基環(huán)69.59 4720.94十八烷酸甲酯51.72 己-2-烯-1酮 4826.969-十八烯-12-炔酸甲酯 1820.30α-可巴烯100.00倍半萜烯4937.26酞酸二丁酯? 1921.99石竹烯44.22 5037.54L-抗壞血酸棕櫚酸酯? 2024.07庫(kù)貝醇100.00倍半萜醇515.41鄰異苯基甲苯97.19其他 2124.36菖蒲烯醇? 5218.912,5-二甲基正己烷-2,5-二甲羥基30.74 2220.053-甲基十三烷?脂肪烴 過氧化物? 2321.23十四烷? 5325.804,8a-二甲基-6-丙基-2,3,7,8-二氫萘? 2425.536-甲基十八烷? 5428.643-甲基-2,6-二氟苯甲酸十六烷基酯100.00 2526.384-甲基十六烷? 5528.985-哌啶糠醛? 2626.553-甲基十五烷? 5631.60L-苯丙氨酸甲酯丁酮鹽? 2730.402,6,10-三甲基十四烷? 5735.937,9-二叔丁基-1-1氧雜螺[4.5]癸-40.45 2829.07β-桉葉醇100.00醇類 6,9-二烯-2,8-二酮59.57 2932.73三十七醇57.08

“?”表示未發(fā)生變化；相對(duì)減少率＝(反應(yīng)前峰面積－反應(yīng)后峰面積)/反應(yīng)前峰面積

“?” indicates no change; relative reduction rate = (pre reaction area－post reaction area ) / pre reaction area

3 討論

3.1 反應(yīng)性頂空系統(tǒng)與傳統(tǒng)方法比較

將水蒸氣蒸餾法與反應(yīng)性頂空法進(jìn)行對(duì)比，比較了兩者提取揮發(fā)油的溫度、時(shí)間，對(duì)ABTS自由基的清除率、操作流程，結(jié)果如表5所示。

與水蒸氣蒸餾法相比，頂空反應(yīng)系統(tǒng)不僅能夠在30 min內(nèi)完成揮發(fā)油的提取，還能夠在一個(gè)金屬浴裝置中對(duì)樣品進(jìn)行批量化處理，節(jié)約了大量時(shí)間，甚至還可根據(jù)樣品量的大小調(diào)整金屬浴模塊，對(duì)稀有藥品等用量小的樣品進(jìn)行處理，而水蒸氣蒸餾不僅耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)于稀有貴重的藥品在用量小的情況下，很難對(duì)其揮發(fā)油進(jìn)行蒸餾提取和濃縮。

表5 反應(yīng)性頂空系統(tǒng)與傳統(tǒng)方法比較(n = 6)

Table 5 Comparison between reactive headspace system and traditional method (n = 6)

方法提取時(shí)間/h提取溫度清除率/%操作流程 水蒸氣蒸餾2～6100 ℃90.69蒸餾-濃縮-揮發(fā)油成分測(cè)定-清除自由基-剩余成分測(cè)定 反應(yīng)性頂空0.5可小于100 ℃88.95原位萃取和反應(yīng)-成分測(cè)定

水蒸氣蒸餾法與HS-SPME提取揮發(fā)油的溫度一般不同，二者所提取的成分也略有不同[31]，水蒸氣蒸餾法提取溫度高，對(duì)熱敏性揮發(fā)油成分影響較大，還需要后續(xù)的濃縮等操作，而HS-SPME因?yàn)榧腿『蜐饪s為一體，溫度低于100 ℃時(shí)也能提取出許多揮發(fā)油[32]，對(duì)一些熱敏性、遇水易分解的成分較為友好，萃取到的是氣體狀態(tài)下的揮發(fā)油，能夠直接和準(zhǔn)確地反映揮發(fā)油成分。HS-SPME在不同加熱溫度下，對(duì)揮發(fā)油的萃取也有差別，主要體現(xiàn)在成分含量上，對(duì)于同一批次JQG來說，100 ℃下，3-甲基-2,6-二氟苯甲酸十六烷基酯和-苯丙氨酸甲酯丁酮鹽的含量高于90 ℃的含量，但3-甲基-2,6-二氟苯甲酸十六烷基酯不屬于抗氧化成分，-苯丙氨酸甲酯丁酮鹽面積相對(duì)減少率僅在40%左右，不是主要的抗氧化成分，因此結(jié)合ABTS自由基穩(wěn)定存在的條件，可將90 ℃定為本實(shí)驗(yàn)所提出的方法對(duì)JQG揮發(fā)油抗氧化活性測(cè)定時(shí)的加熱溫度。此外，本方法在該溫度下的JQG揮發(fā)油對(duì)ABTS的清除率為88.95%，接近水蒸氣蒸餾的90.69%，也具有較好的清除自由基效果，RSD值為1.91%，符合測(cè)定要求。

與水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油和清除ABTS自由基的操作流程相比，本方法可原位一步完成，將傳統(tǒng)方法的提取、分離、轉(zhuǎn)移、濃縮、清除反應(yīng)等過程縮減在一個(gè)容器中，且揮發(fā)油釋放-萃取-反應(yīng)全過程密閉，保證了反應(yīng)的效率和精密度，一步完成揮發(fā)油的釋放-清除自由基-頂空微萃取進(jìn)樣3個(gè)反應(yīng)過程，實(shí)現(xiàn)萃取-反應(yīng)一體化。在不影響頂空反應(yīng)池中自由基的穩(wěn)定性條件下，能夠在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)揮發(fā)油釋放并傳質(zhì)進(jìn)入頂空，與反應(yīng)池中自由基發(fā)生清除反應(yīng)；在反應(yīng)過程中任何時(shí)刻，均可插入固相微萃取針在頂空原位萃取揮發(fā)油，便于后續(xù)GC-MS分析成分；避免了已有方法溶液多次轉(zhuǎn)移、容器開口等導(dǎo)致的揮發(fā)油損失和熱分解；能夠直接反應(yīng)樣品揮發(fā)油本身對(duì)ABTS自由基的清除效果，這樣簡(jiǎn)單的操作也保證較高的清除率、試驗(yàn)的精密度和重復(fù)性。

3.2 揮發(fā)油抗氧化成分變化分析

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物中三萜等萜類化合物具有良好的抗氧化活性[33-35]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JQG中的部分單萜、倍半萜等也同樣具有良好的抗氧化活性，其中相對(duì)減少率為100%的萜類揮發(fā)油有5種，包括羅勒烯、4-氯異龍腦、6-甲基-3-異丙基-2-羥基環(huán)己-2-烯-1-酮、α-可巴烯、庫(kù)貝醇。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析其抗氧化性良好的原因可能是，它們都含有異戊烯或者異戊烷，屬于萜類化合物，其中羅勒烯和6-甲基- 3-異丙基-2-羥基環(huán)己-2-烯-1-酮含有共軛雙鍵與活潑氫，其余3種均含有雙鍵和活潑的氫，它們可能更容易發(fā)生加成反應(yīng)、被氧化成其他物質(zhì)或者被自由基完全消耗。非萜類揮發(fā)油中，許多具有醛酮結(jié)構(gòu)的化合物也有著良好的抗氧化能力，如瓜菊醇酮、α-細(xì)辛腦、丹皮酚、β-桉葉醇、棕櫚油酸等，它們都具有醛酮、羥基、烯烴等結(jié)構(gòu)存在著較為活潑的基團(tuán)，可能被ABTS自由基氧化，從而發(fā)揮它們清除自由基的作用。

3.3 展望

通過2個(gè)方面體現(xiàn)對(duì)JQG揮發(fā)油抗氧化活性的研究，一是JQG揮發(fā)油本身對(duì)ABTS的清除效果，二是對(duì)其揮發(fā)油中抗氧化活性進(jìn)行了分析。反應(yīng)性頂空系統(tǒng)的建立提供了一種氣體本身清除自由基的方法，為進(jìn)一步體外篩選抗疫中藥中優(yōu)質(zhì)的抗氧化成分提供了新思路，為藥中揮發(fā)油抗氧化活性的研究提供新方法，也為研究中藥藥效提供一種較為直接的方法和參考。但本實(shí)驗(yàn)只從新冠肺炎患者會(huì)產(chǎn)生自由基發(fā)生氧化損傷，而JQG揮發(fā)油具有清除自由基的作用，以期為JQG在新冠肺炎病程中的治療作用和機(jī)制提供參考，由于實(shí)驗(yàn)室條件有限，未能直接對(duì)JQG揮發(fā)油抗擊新冠病毒的效果進(jìn)行研究，但已有本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，后續(xù)可對(duì)反應(yīng)池中自由基進(jìn)行更換，換為病毒感染后的細(xì)胞、組織等，進(jìn)一步研究中藥中揮發(fā)油清除自由基、清除病毒等，為中醫(yī)學(xué)中的芳香療法提供可靠方法。

此外，針對(duì)本系統(tǒng)中由于樣品堆積導(dǎo)致樣品用量增加，揮發(fā)油清除自由基效果并未一直增加的情況，在后續(xù)對(duì)其他樣品及其揮發(fā)油進(jìn)行研究時(shí)，加入了適量的石英砂，增大樣品基質(zhì)間的空隙，提高了清除率。因?yàn)榉磻?yīng)性頂空系統(tǒng)是首次提出，還有不足之處，希望與對(duì)此感興趣的學(xué)者進(jìn)行探討。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on antioxidant activity of volatile oil from Jinhua Qinggan Granules based on reactive headspace system

DING Gang-xin1, YIN Jin-fang1, CUI En-hao1, ZOU Wei1, SHI Feng1, ZHAO Jian-song3, XIONG Hua-bin1, YANG Zhi1, GAO Yun-tao1, 2

1. Yunnan Minzu University, Kunming 650500, China 2. Yunnan International Joint Research Center for clean utilization of biomass resources in cross-border ethnic areas, Yunnan University for nationalities, Kunming 650500, China 3. Hunan Agricultural University, Changsha 410000, China

A reactive headspace system was designed, including a reactive headspace bottle of an plug-in reaction tank and an auxiliary heating device, which was used to study the antioxidant activity of volatile oil in traditional Chinese medicine, the methods of antioxidant activity evaluation and component analysis of volatile oil were established.The auxiliary heating device heats the bottom of the reactive headspace bottle and the infrared thermal imager studies the temperature distribution of the reactive headspace bottle; the volatile oil enters the headspace and scavenges the free radical in the interpolation reaction tank; the change of absorbance of free radical is measured by spectrophotometry; the changes of components before and after headspace volatile oil removal reaction were determined by SPME-GC-MS to characterize the antioxidant components.The improved metal bath auxiliary heating device realizes the temperature difference between the sample area and the headspace more than 50 ℃, so that the volatile oil can be quickly released into the headspace and avoid the thermal decomposition of free radicals. When the dosage of Jinhua Qinggan Granule (JQG) was 1.50 g, the sample temperature was 90 ℃, and the reaction time was 30 min, the free radical scavenging rate of JQG’s volatile oil to the 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) was 88.95% (= 6, RSD = 1.91%); The RSD (= 8) of the precision and repeatability of the established antioxidant activity evaluation method were 2.50% and 1.24%; the solid-phase microextraction needle was sampled in situ from above the headspace reaction tank, and 57 kinds of volatile oils were identified by GC-MS analysis, including pinene, artemisinin, etc. among them, 35 kinds had a peak area reduction of more than 30% before and after the removal reaction, accounting for 61.40% of the total volatile oils. Therefore, it is inferred that the components with antioxidant activity are mainly terpenoids, aldehydes, ketones, phenolic acids and other compounds, mainly including basilene α-asarone, etc.The volatile oil of JQG has good antioxidant activity; the reactive headspace system can complete the three reaction processes in a small closed reaction bottle in one step, including release, removal with free radical and headspace microextraction injection of volatile oil; this method is rapid, efficient and reproducible, and it can be used to evaluate the antioxidant activity and identify the active components of the volatile oil of traditional Chinese medicine.

reactive headspace system; SPME; GC-MS; Jinhua Qinggan Granules; volatile oil; antioxidant activity; free radical; pinene; artemisinin; terpenoids; aldehydes and ketones; phenolic acid; basilene; α-asarone

R283.6

A

0253 - 2670(2022)13 - 3972 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.010

2022-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21367025）；云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017FD118）

丁崗芯，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ芸寡趸煞值姆治雠c評(píng)價(jià)。Tel: 15012355553 E-mail: 517308180@qq.com

高云濤，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ芸寡趸煞值姆治雠c評(píng)價(jià)。Tel: 13888610792 E-mail: 2314972096@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]