CyHV-2毒株CNDF-TB2015保存條件與增殖特征研究

文/朱悅 藺凌云 潘曉藝 鞏金鵬 姚嘉赟 沈錦玉

鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）是危害鯉科魚類的主要病原之一，主要宿主是金魚（）、鯽魚（）及其普通變種，2016年被列入《國家水生動物疫病監(jiān)測計劃》。

CyHV-2最早于1992年在日本觀賞金魚中發(fā)現(xiàn)，是第二個從鯉科魚類分離出來的皰疹病毒，因此被命名為鯉皰疹病毒II型。隨后在中國臺灣、澳大利亞、美國、英國的養(yǎng)殖金魚中相繼發(fā)現(xiàn)。2011年，匈牙利首次在養(yǎng)殖的銀鯽體內(nèi)檢測到CyHV-2，隨后，CyHV-2感染銀鯽的報道逐漸增多，Wang等在2012年首次報道了CyHV-2感染我國內(nèi)地異育銀鯽。此病原引發(fā)的病情進展迅速，死亡率高達90%～100%，給鯽魚養(yǎng)殖造成了重大損失。

病毒的細胞培養(yǎng)分離技術(shù)是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測魚類病毒的首選方法。然而，CyHV-2在現(xiàn)有魚類常用細胞系中難以進行傳代，胖頭鯉細胞（fathead minnow cells，F(xiàn)HM）、草魚腎細胞（grass carp kidney，CIK）、草魚卵巢細胞（grass carp ovary，CO）、鯉魚上皮瘤細胞（epithelioma popuasum cuprini，EPC）均對CyHV-2不敏感，僅錦鯉鰭細胞（koi fin 1，KF-1）能產(chǎn)生致細胞病變效應(yīng)（CPE），但病毒在KF-1細胞中傳至第3代～5代后，致細胞病變效應(yīng)消失且病毒核酸PCR檢測也呈陰性。2013年Ito等采用金魚鰭細胞系（goldfish fin，GFF）和standard Ryukin Takafumi（SRTF）細胞系成功實現(xiàn)了對CyHV-2進行持續(xù)傳代，浸泡感染結(jié)果發(fā)現(xiàn)25℃條件下致死率顯著高于20℃水溫，并且腎臟是該病毒的最主要復制組織。而魏鈺娟等建立的異育銀鯽脊髓組織細胞系（Spinal cord tissue cell lines of，CSC），也實現(xiàn)了對CyHV-2持續(xù)傳代，并且傳代毒呈現(xiàn)高病毒滴度。

雖然經(jīng)過國內(nèi)外學者的努力，實現(xiàn)了CyHV-2的細胞傳代，但對該病毒的增殖特征和不同保存條件下活力的衰減報道較少。因此，本研究將針對CyHV-2毒株CNDF-TB2015的培養(yǎng)條件及其在細胞系CSC和鯽魚體內(nèi)的增殖特征與病毒的保存條件進行研究，為CyHV-2的生物學特性提供研究基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

一、材料與方法

（一）實驗材料

實驗用異育銀鯽（體重約150g/尾）來自浙江省淡水水產(chǎn)研究所試驗基地，經(jīng)檢測CyHV-2陰性；異育銀鯽脊髓組織細胞系CSC、CyHV-2-毒株CNDF-TB2015毒株由本實驗室保存。

另備有L-15培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、DNA核酸提取試劑、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T載體、T25細胞培養(yǎng)瓶、移液管等。

（二）培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.吸附時長對病毒培養(yǎng)的影響

將濃度為10TCID/mL的細胞培養(yǎng)病毒液按0.5mL/瓶的量分別接種12瓶T25細胞瓶的CSC細胞中，置于24℃孵育不同時間，按不同孵育時間（20min、40min、60min和80min）分4組，每組3瓶。孵育完成后進行細胞觀察，去除病毒液后加入維持液放置于培養(yǎng)箱，24℃培養(yǎng)，每日觀察細胞病變情況。

2.溫度對病毒培養(yǎng)的影響

將接種病毒后的CSC細胞，分別放置于16℃、24℃和30℃條件下進行培養(yǎng)，定期進行細胞病變觀察。

（三）不同保存溫度條件下病毒活力測定

將濃度為10TCID/mL的新鮮CNDF-TB2015病毒液分別保存于4℃、-20℃、-80℃及液氮（-196℃）中，每隔一周將保存的病毒液重新感染CSC細胞，每日顯微鏡觀察細胞病變情況。

（四）在CSC細胞中的增殖特征

將濃度10TCID/mL的CNDFTB2015毒株接種至狀態(tài)良好的CSC細胞中，在第6h、9h、12h、24h、48h、60h、72h、96h、120h和142h進行細胞樣品的收集，并在各時間點進行細胞病變觀察。對采集的樣品按Reed-Muench法測定TCID，并采用DNA提取試劑盒提取細胞培養(yǎng)物凍融液DNA，采用TaqMan-qPCR法，以含靶標片段的質(zhì)粒為標準品，進行病毒拷貝數(shù)的測定。

（五）在魚體內(nèi)的增殖特征

對健康鯽魚采用濃度為10TCID/mL的病毒液進行腹腔注射攻毒，攻毒劑量0.2mL/尾，設(shè)三個攻毒組（12尾/組），同時設(shè)立三個對照平行組（12尾/組）注射相同體積的生理鹽水，于24℃循環(huán)水中養(yǎng)殖。攻毒前和攻毒后7d內(nèi)每天取脾、腎組織，并提取總DNA，采用qPCR法檢測組織中的病毒含量變化。

二、結(jié)果

（一）病毒培養(yǎng)條件

CyHV-2在24℃下孵育20min、40min后病變情況基本一致，第4d開始病變，細胞脫落，出現(xiàn)空斑，第7d病變80%。病毒孵育60min后就出現(xiàn)少量細胞脫落的現(xiàn)象，而病毒孵育80min后細胞全部脫落。因此，CyHV-2的孵育時長宜控制在20min～40min，利于細胞病變的觀察。

加入維持液后，各培養(yǎng)溫度下3d內(nèi)細胞均無脫落現(xiàn)象，觀察至第7d，16℃下細胞未出現(xiàn)病變，24℃下細胞出現(xiàn)變圓、脫落、融合、裂解并形成空斑等病變，病變區(qū)占總面積達80%左右，而30℃時第7d病變面積達50%左右。不同溫度下病毒感染第7d細胞病變?nèi)鐖D1所示，根據(jù)不同溫度下細胞病變情況，說明CyHV-2病毒的最佳培養(yǎng)溫度為24℃。

圖1 病毒感染第7a細胞病變a：16℃；b：24℃；c：30℃

（二）病毒的保存溫度

將不同溫度下保存不同時間的CNDF-TB2015病毒培養(yǎng)液（10TCID/mL）接種CSC細胞，出現(xiàn)病變的時間和病變程度呈現(xiàn)差異（見表1）。病毒液在4℃和-80℃保存21d內(nèi)、液氮（-196℃）中保存168d內(nèi)，接種CSC細胞后8d內(nèi)都可以出現(xiàn)80%以上的病變，而在-20℃保存7d的病毒液，接種CSC細胞后未出現(xiàn)細胞病變；在-80℃條件下隨著保存時間的增加，病毒毒力逐漸減弱；但在液氮中保存的病毒毒力168d內(nèi)基本不變。

表1 保存溫度對病毒毒力的影響

（三）CyHV-2在CSC細胞中的增殖特征

由圖2可以看出，相比正常CSC細胞，該病毒感染CSC細胞24h后，部分細胞聚集，48h后小部分細胞脫落出現(xiàn)空斑，72h后細胞持續(xù)聚集，空斑增多，96h后細胞空斑變大，細胞碎片增多，初步形成網(wǎng)狀，120h后細胞聚集融合脫落，網(wǎng)狀面積擴大。

圖2 病毒感染細胞后病變情況

對各時間點收集的病毒液進行滴度測定，由圖3可見，CNDF-TB2015毒株感染CSC細胞后，6h病毒已開始復制，但感染滴度較低；9h～12h病毒滴度緩慢增加；12h～24h病毒進入對數(shù)增長期，滴度急劇上升；24h后病毒增殖速度減緩，至96h病毒滴度達到最高值10TCID/mL；96h～120h病毒增殖進入平臺期，病毒滴度維持在較高水平；142h時病毒液的感染滴度開始下降。

圖3 病毒增殖曲線

同時測得各時間點的病毒拷貝數(shù)，由圖4可知，6h～12h病毒復制水平較低；12h～24h病毒拷貝數(shù)急劇增長；24h～48h緩慢上升，48h～72h又表現(xiàn)出明顯上升；96h時到達峰值，病毒拷貝數(shù)達7.5×10copies/μg；此后病毒拷貝數(shù)隨時間增加逐漸下降。由此可見，CNDF-TB2015毒株的拷貝數(shù)與其滴度的變化趨勢基本一致。

圖4 病毒載量隨時間變化的曲線

（四）CyHV-2在魚體內(nèi)的增殖情況

CNDF-TB2015毒株感染鯽魚后，每隔24h取3尾魚的脾、腎組織，提取DNA并用qPCR檢測其病毒拷貝數(shù)，測得脾臟和腎臟組織中病毒載量變化見圖5。感染后第3d，病毒在魚體內(nèi)迅速增殖，病毒載量較高，維持在3×10copies/μg～1.8×10copies/μg，且脾臟組織中的病毒載量高于腎臟組織。脾、腎組織的病毒載量分別于第2d和第3d達到最高值，分別為1.8×10copies/μg、4.4×10copies/μg，此后均逐漸下降，第7d病毒載量分別降至9.2×10copies/μg、2.2×10copies/μg。試驗期間，感染魚未發(fā)生死亡，在第3d開始部分試驗魚出現(xiàn)胸鰭出血癥狀，已進行采樣檢測。

圖5 脾臟、腎臟中病毒含量的變化

三、討論

（一）病毒培養(yǎng)條件

體外培養(yǎng)條件極大地影響病毒，對病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化及對病變特性的了解，將有助于提高病毒分離的成功率和病毒的產(chǎn)量，對鯽魚皰疹病毒病的診斷、流行病學調(diào)查和CyHV-2細胞滅活疫苗制備具有重要意義。

本研究將CyHV-2毒株CNDFTB2015接種異育銀鯽脊髓組織細胞系（CSC），觀察了在不同孵育時間和培養(yǎng)溫度下，CSC細胞的病變發(fā)生情況，確定了該毒株的適宜培養(yǎng)條件即孵育時間為20min～40min，培養(yǎng)溫度為24℃。該毒株培養(yǎng)7d后，16℃無病變，24℃病變80%以上，30℃病變率約50%，這與已報道的CyHV-2的體外培養(yǎng)溫度基本一致。Shibata等利用RyuF-2細胞系培養(yǎng)CyHV-2，發(fā)現(xiàn)30℃和32℃條件下，病毒滴度明顯低于20℃和25℃，且25℃條件下，病毒滴度最高且增長最快，但培養(yǎng)溫度為34℃或更高時，病毒不能增殖。Ma等建立的異育銀鯽腦組織細胞系GiCB和Lu建立的異育銀鯽尾鰭細胞系GiCF，均實現(xiàn)了CyHV-2的傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為28℃和25℃?？梢?，CyHV-2在體外的培養(yǎng)溫度與鯽魚造血器官壞死病的流行溫度基本相符，該病在20℃～25℃最為嚴重，超過30℃或低于10℃，該病較少發(fā)生。另外，本研究中病毒吸附時間超過60min，出現(xiàn)了細胞脫落的現(xiàn)象，這可能與病變細胞裂解液中存在細胞毒性物質(zhì)有關(guān)。

（二）病毒保存條件

保存溫度和時間是影響病毒感染力的重要因素，本文將收獲的同批次病毒液進行分裝后，儲存于不同溫度條件下，定時復蘇，觀察試驗樣本感染后的細胞病變情況。結(jié)果表明，該病毒在-196℃下（即液氮中）保存效果最好；-80℃下保存時間超過21d，CPE的出現(xiàn)時間發(fā)生延遲；4℃僅適用于病毒的短期保存，且存放時間不得超過21d；-20℃條件下，病毒的感染力下降最快，保存7d后對CSC細胞喪失感染力，可能該溫度下病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導致病毒囊膜破裂缺失，最終造成病毒不能通過膜內(nèi)吞或融合的方式感染細胞。Shibata等的研究亦表明，CyHV-2病毒液在4℃和-80℃條件下保存，7d內(nèi)病毒的感染力保持相對穩(wěn)定，而-25℃條件下，7d內(nèi)病毒滴度急劇下降。其它具囊膜的病毒也有類似特征，如國內(nèi)學者對不同保存溫度下偽狂犬病毒病毒液的滴度進行比較，發(fā)現(xiàn)-20℃保存的病毒滴度下降最快，-70℃及-80℃下，30d內(nèi)偽狂犬病毒的滴度相對穩(wěn)定，短期內(nèi)4℃的保存效果好于-20℃。李瑩瑩等將含CCB細胞的KHV病毒液在不同溫度條件下保存90d后，測定病毒滴度，結(jié)果顯示4℃及-20℃保存的病毒感染力分別下降61%和50%，而于-80℃及液氮中保存的病毒感染力僅下降7%。一般情況下，保存溫度越低，病毒的滴度變化越小，但隨著保存時間的延長，病毒滴度伴隨發(fā)生不同程度的下降。明確保存條件對CyHV-2感染力的具體影響，將對CyHV-2的研究工作具有指導意義。

（三）病毒增殖特征

本文分別基于TCID和拷貝數(shù)繪制了CNDF-TB2015毒株在CSC細胞上的增殖曲線，兩條增殖曲線變化趨勢基本一致。該毒株感染CSC細胞后12h內(nèi)為病毒緩慢增長期，12h～96h為對數(shù)增長期，96h～120h為平臺期，120h后開始衰亡。對病毒在宿主細胞內(nèi)的增殖情況和病毒感染動力學的了解，可為病毒培養(yǎng)的最佳收獲時間提供依據(jù)。

TCID體現(xiàn)的是具有感染活力的病毒粒子數(shù)量，而熒光定量PCR法結(jié)果反映的是病毒基因組的拷貝數(shù)，這其中就包含一些未完成包裝的病毒。在細胞感染后期，特別是120h后，病毒拷貝數(shù)下降速率與TCID基本一致，但TCID下降幅度更大，這也與具囊膜病毒穩(wěn)定性低、DNA不易降解的情況一致。

Wu等和Ito等的研究均表明，脾和腎臟是CyHV-2感染和復制的主要靶器官，因此本研究選擇脾和腎臟組織進行病毒在宿主體內(nèi)增殖規(guī)律的研究材料。水溫（25±1）℃，采用亞致死劑量（0.1LD，數(shù)據(jù)未發(fā)表）CNDF-TB2015毒株進行感染試驗，此時CyHV-2在魚體內(nèi)為急性感染類型，前4d病毒復制水平較高，脾、腎組織中的病毒載量急劇增加。4d后，病毒開始被激活的宿主免疫系統(tǒng)清除，載量迅速降低，檢測結(jié)束時（第7d），魚體中的病毒載量相比最高值，下降了4個數(shù)量級。潛伏感染是皰疹病毒的一個顯著特征，CyHV-2的潛伏感染也已被證實。本感染條件下，CyHV-2在魚體內(nèi)經(jīng)歷了急性感染期，病毒含量急劇上升后迅速下降，7d后病毒是否繼續(xù)降低，直至被完全清除，亦或在魚體中轉(zhuǎn)為潛伏感染，仍有待進一步研究。

四、結(jié)論

本研究利用CSC細胞培養(yǎng)CyHV-2毒株CNDF-TB2015，優(yōu)化了該毒株的培養(yǎng)條件，確定了病毒吸附最佳時長為20min～40min，病毒培養(yǎng)最適宜溫度為24℃。測定了不同保存條件下，CNDF-TB2015病毒液的感染力變化情況，并對該毒株在體外組織細胞和魚體內(nèi)的增殖特征進行了研究，結(jié)果表明，在4℃保存21d和-80℃保存168d，病毒還保存較高毒力，長期需保存于液氮中，病毒不適合保存在-20℃。這為CyHV-2的分離培養(yǎng)、保存及細胞滅活疫苗的制備提供科學依據(jù)，對CyHV-2生物學特性、致病機理的研究和鯽魚造血器官壞死病的防治具有參考價值。