茚三酮比色法測定凍干藥膳雞湯中氨基酸含量

◎侯旭南 楊妍 林川 劉犇 徐青霞

本文利用茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生特征顏色，改變?nèi)芤旱奈舛龋捎每梢姽夥止夤舛确▽?duì)藥膳雞湯及其凍干粉中的氨基酸含量進(jìn)行分析，建立快速評(píng)價(jià)凍干藥膳雞湯的新方法。測定結(jié)果表明，茚三酮法測定凍干粉中氨基酸含量具有良好的線性（R2=0.9996），準(zhǔn)確性（回收率 98.51%～101.61%）。12 種凍干藥膳雞湯中氨基酸含量介于540～2510μg/ml 之間；凍干藥膳雞湯中氨基酸含量隨其煎煮時(shí)長和食鹽的增加而提高。

中醫(yī)藥膳學(xué)是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下研究食藥兩用食材的理論及應(yīng)用的學(xué)科，是中醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要組成部分，是在長期實(shí)踐中積累逐漸形成的經(jīng)驗(yàn)學(xué)科。由于食療藥膳的傳統(tǒng)烹飪方式商品化程度過低，無法滿足快節(jié)奏時(shí)代的需要，導(dǎo)致其在現(xiàn)代社會(huì)的推廣受限。隨著真空冷凍干燥技術(shù)成本的降低，凍干藥膳產(chǎn)品有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。藥膳雞湯作為受眾人群最為廣泛的食療藥膳，是以藥食兩用的中藥與雞肉及天然調(diào)料熬煮而成?！秲?nèi)經(jīng)》記載，藥膳雞湯有益氣溫中、填精補(bǔ)虛、健脾胃、益五臟、強(qiáng)筋壯骨的功效，適用于營養(yǎng)不良、畏寒肢冷、易疲勞、月經(jīng)不調(diào)等癥狀。雞肉營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，含有多種人體必須氨基酸。以雞肉為基礎(chǔ)開發(fā)藥膳雞湯，并以現(xiàn)代凍干技術(shù)制備方便快捷的藥膳雞湯凍干粉可以實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)、功能和便捷性的高度融合。藥膳凍干雞湯的開發(fā)有利于藥膳的推廣和工業(yè)化生產(chǎn)，是藥膳雞湯未來研究和發(fā)展的趨勢。

谷氨酸是酸性氨基酸，分子內(nèi)含兩個(gè)羧基增加了其在極性溶劑中的溶解能力，因此微溶于水。谷氨酸幾乎不溶于乙醚等非極性溶劑，也不溶于甲醇和乙醇。谷氨酸作為食品行業(yè)常見的呈鮮物質(zhì)之一，對(duì)雞湯鮮味具有重要的貢獻(xiàn)。L-谷氨酸可作為藥品參與大腦的蛋白質(zhì)代謝，促進(jìn)氧化，是人腦中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)以谷氨酸為研究目標(biāo)，利用谷氨酸與茚三酮反應(yīng)生成特征顏色的原理，采用可見光分光光度法測定570nm波長下溶液的吸光度，根據(jù)朗伯-比爾定律計(jì)算其中的游離氨基酸的含量。本方法簡便實(shí)用，不需要復(fù)雜儀器。以幾種不同工藝制備的凍干藥膳雞湯為研究對(duì)象，對(duì)凍干粉中氨基酸檢測條件進(jìn)行探究，對(duì)氨基酸含量進(jìn)行測定，以此建立起簡便、高效測定凍干藥膳雞湯中氨基酸含量的方法并篩選出凍干藥膳雞湯的最佳工藝，可為中醫(yī)食療藥膳工業(yè)化生產(chǎn)提供思路。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1.試驗(yàn)儀器。

真空冷凍干燥機(jī)，LGJ-10，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；pH 計(jì)，PHS25，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；紫外及可見分光光度計(jì)，721，江蘇江東精密儀器有限公司；電子天平，JT1003B，鶴壁市瑞普儀器儀表有限公司。

2.試驗(yàn)試劑。

谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院；苯駢戊三酮（茚三酮），AR，天津市奧普升化工有限公司；檸檬酸，AR，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉，AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氯化亞錫；分析純，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司。

3.溶液的制備。

（1）谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。

精密稱取200.00 mg 干燥的谷氨酸于燒杯中，加入100 mL 水溶解，轉(zhuǎn)移至1L 容量瓶，定容至刻度，即得谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液200 μg/mL，作為母液保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）2%茚三酮溶液的配制備。

精密稱取1.00g 茚三酮，加入35mL 乙醇，低溫加熱溶解。加入40mg 氯化亞錫，攪拌過濾，加乙醇定容至50mL，冷卻后放置于0℃~5℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）緩沖溶液的制備。

0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：將28.40g 磷酸氫二鈉用蒸餾水定容至1L 備用。

0.1mol/L 檸檬酸溶液：21.01g 檸檬酸加蒸餾水溶解，定容至 1L 備用，分別配制 pH 為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的緩沖溶液。

4.樣品的前處理。

（1）樣品的來源。

實(shí)驗(yàn)所用雞骨架采購自超市，來源于黑龍江正大實(shí)業(yè)有限公司；干人參購于藥店，枸杞、紅棗、料酒、復(fù)合香辛料、蔥、姜購于本地生鮮超市。

（2）樣品前處理。

藥膳雞湯的制備稱取相同質(zhì)量（每份100 g）新鮮雞骨架，剔除雞油脂及內(nèi)臟，清洗干凈，切成邊長約7 cm 的肉塊，用沸水焯后各加入2.5 倍水（質(zhì)量比）、1%的料酒、0.025%復(fù)合香辛料、0.7%蔥和姜，0.9%紅棗、0.7%枸杞、0.3%干人參，分別加入1.0%、1.5%、2.0%的食鹽，置于隔水燉鍋中，在煲湯模式下分別加熱煮制 0.5、1.0、1.5、2.0h。

（3）樣品的制備。

取相同質(zhì)量煮制完成的藥膳雞湯各50g，靜置冷卻，撇去油脂，用200 目絹布過濾，收集濾液置于0-4℃冰箱保鮮24h，再次分離上層黏稠油脂，置于-5℃以下溫度冷凍至完全固化，隨后在-45℃的環(huán)境中下真空冷凍干燥24h，得凍干藥膳雞湯樣品12 份。

（4）操作注意點(diǎn)。

①100g 雞骨架冷水浸泡清洗，連同骨架上所附帶的肉質(zhì)，于沸水中預(yù)處理1 min，除去表層浮沫，撈出冷卻瀝干備用。

②原料冷水處理先用旺火，后用慢火。其目的主要為先使原料中的水溫得到迅速提高，再次改為慢火，使材料中的營養(yǎng)成分溶解。如果持續(xù)使用旺火，材料內(nèi)部的蛋白質(zhì)就可能會(huì)凝固，無法繼續(xù)溶解溢出。

研究溶液pH、顯色劑用量、加熱及冷卻時(shí)間對(duì)谷氨酸溶液吸光度的影響，選出最佳檢測條件并測定凍干藥膳雞湯樣品的氨基酸含量。

二、結(jié)果

1.反應(yīng)條件的選擇。

氨基酸溶液與茚三酮共熱生成茚二酮胺，其顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，可根據(jù)茚二酮胺在570 nm 處吸光度值測定氨基酸的含量。

（1）溶液 pH 的影響。

取6 支 25 mL的比色管，分別加1mL的 pH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的緩沖鹽溶液與 1.0 mL茚三酮溶液、2.0 mL谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、2.0mL水，在100 ℃條件下水浴加熱15min，冷卻10min，加水定容至25mL。分別測其570 nm 處吸光度值。結(jié)果如圖1 所示：谷氨酸溶液在pH 8.0 處有最大吸光度。

圖1 pH 對(duì)谷氨酸溶液吸光度的影響

（2）顯色劑用量的影響。

陳武在致辭中表示，廣西壯族自治區(qū)成立60年來，全區(qū)各族人民共同團(tuán)結(jié)奮斗、共同繁榮發(fā)展，創(chuàng)造了令人矚目的成就。第十二屆園博會(huì)的舉辦是廣西貫徹習(xí)近平生態(tài)文明思想、推進(jìn)生態(tài)文明建設(shè)的重要實(shí)踐，是打造廣西“山清水秀生態(tài)美”金字招牌的重要機(jī)遇。廣西各族人民將全力當(dāng)好東道主，努力打造一屆精彩圓滿、特色濃郁的園林盛會(huì)，誠邀各界朋友到廣西走走看看，親身感受八桂壯鄉(xiāng)的獨(dú)特魅力。

取 7 支在 25 mL的比色管，分別加入 0.7、1.0、1.2、1.5、1.7、2.0、2.2 mL的2.0%茚三酮溶液與3.0 mL 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、1.0 mL緩沖鹽溶液然后分別補(bǔ)入 2.3、2.0、1.8、1.5、1.3、1.0、0.8 mL水，在100 ℃條件下水浴加熱15min，冷卻10min，加水定容至25mL。分別測其570 nm 處吸光度值。結(jié)果如圖2 所示：初始階段顯色劑用量與吸光度成劑量增長關(guān)系，吸光度數(shù)值先增大后趨于平衡，在2.0mL處接近最大值；根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定取2.0 mL為茚三酮用量。

圖2 顯色劑用量對(duì)谷氨酸溶液吸光度的影響

（3）加熱時(shí)間的影響。

取7 支25 mL的比色管，分別加1mL的pH 為8 的緩沖鹽溶液與1.0 mL 茚三酮溶液、2.0 mL谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、2.0mL水，在 100 ℃條件下水浴加熱 10、12、14、15、16、18、20min，冷卻10min，加水定容至25mL。分別測其570 nm 處吸光度值。結(jié)果如圖3 所示：吸光度數(shù)值先增大后下降，在15 min 處達(dá)到最大吸光度值。

圖3 加熱時(shí)間對(duì)谷氨酸溶液吸光度的影響

（4）冷卻時(shí)間的影響。

取6 支25 mL的比色管，分別加1mL的pH8 的緩沖鹽溶液與1.0 mL 茚三酮溶液、2.0 mL谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、2.0mL水，在100 ℃條件下水浴加熱 15min。分別冷卻 6、8、10、12、14、16min，加水定容至25mL。分別測其570 nm 處吸光度值。結(jié)果如圖4 所示：吸光度隨者冷卻時(shí)間的延長先增大后降低，在冷卻10 min 處達(dá)到最大值。

圖4 冷卻時(shí)間對(duì)谷氨酸溶液吸光度的影響

2.氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

取 7 支 25 mL 的比色管，分別加 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與1mL的pH 8 緩沖鹽溶液、1.0 mL茚三酮溶液、加水至容積為6mL，在100 ℃條件下水浴加熱15min，分別冷卻15min，加水定容至25mL。分別測其570 nm 處吸光度值。繪制谷基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

以標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖5 可知，谷氨酸溶液濃度與吸光度呈線性相關(guān)，其回歸方程為y=0.0035x-0.1859，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

圖5 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.凍干藥膳雞湯樣品中氨基酸含量的測定。

取 25 mL 的比色管，分別加入 2.0 mL稀釋（1：20）后的凍干藥膳雞湯樣品，5.0 mL的pH 8 緩沖鹽溶液、2.0%茚三酮溶液，在100 ℃條件下水浴加熱15min，冷卻至室溫后，加水定容至25 mL，測定其在570 nm 吸光度值。

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4.加樣回收率試驗(yàn)。

取1 mL 稀釋后的樣品，測定凍干藥膳雞湯氨基酸總量作為本底量，以50 μg 和100 μg 的谷氨酸純品作為加標(biāo)量，進(jìn)行8 次比色測定。由表可知，平均回收率為100.205%，RSD=1.19%，表明此法準(zhǔn)確度高且重現(xiàn)性好。

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三、討論

1.采用茚三酮顯色法測定的凍干藥膳雞湯氨基酸含量在540～2510μg/mL 范圍，該法具有線性好、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。

2. 凍干藥膳雞湯中氨基酸含量受與制備工藝的影響較大，除了與煮制時(shí)長有關(guān)。在煮制過程中增加食鹽的量能有利于藥膳雞湯的氨基酸的溶出，另外2%的食鹽添加量風(fēng)味口感更佳。