基于UPLC-MS/MS的松齡血脈康膠囊血清藥物化學(xué)研究△

郝曉鋒，趙曼茜，肖云川，葉亮，柯瀟

成都康弘制藥有限公司，四川 成都 610036

松齡血脈康膠囊由葛根、鮮松葉、珍珠層粉組方而成，是一種用于平肝潛陽、鎮(zhèn)心安神的中成藥。目前，已從松齡血脈康膠囊各組分中系統(tǒng)地分離和鑒定了數(shù)百種化合物[1-4]，但其潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本研究根據(jù)血清藥物化學(xué)的相關(guān)理論基礎(chǔ)結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），初步研究松齡血脈康膠囊的血清藥物化學(xué)，以探究其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體（SPF）級雄性SD 大鼠10只，體質(zhì)量160～220 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2014-028，實(shí)驗(yàn)前動物適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，禁食12 h，自由飲水。

1.2 試藥與儀器

松齡血脈康膠囊（批號：140656，成都康弘制藥有限公司）；鮮松葉、葛根藥材（成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號分別為20150501、1504001）由成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授分別鑒定為馬尾松Pinus massonianaLamb.的松針和野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi 的干燥根；對照品葛根素（批號：110752-201313，純度：98%）、大豆苷（批號：111738-201302，純度：91.3%）和大豆苷元（批號：111502-200402）購于中國食品藥品檢定研究院；對照品芒柄花苷（批號：xFO65770，純度＞98%，英國Biosynth Carbosynth 公司）；對照品馬尾松苷B、馬尾松苷D、(6S,7E,9R)-長壽花苷、異落葉松脂醇-9′-O-阿拉伯糖苷和兒茶素（純度＞98%，實(shí)驗(yàn)室前期分離）；色譜純乙腈和甲醇（韓國Honeywell Burdick&Jackson 公司）；AR 級甲酸（批號：2015030201，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；其他試劑為分析級；1290 型UPLC 儀（美國安捷倫公司）；Quest LTQ 型質(zhì)譜儀（美國Thermo 公司）；Milli-Q Biocel型超純水儀（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 松齡血脈康膠囊樣品的制備

松齡血脈康膠囊研磨成細(xì)粉，精確稱量100 mg，加入蒸餾水10 mL，超聲提取10 min（600 W，40 kHz），0.45 μm濾膜濾過，取濾液10 μL進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.2 血漿樣品的制備

松齡血脈康膠囊內(nèi)容物用蒸餾水分散作為儲備溶液（0.5 g·mL-1）。將上述儲備液灌胃給予5 只大鼠（10 mL·kg-1），將等劑量的蒸餾水灌胃給予另外5 只大鼠作為對照。大鼠給藥后60 min，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，從腹主動脈收集血液，4 ℃、1000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8.6 cm）分離上清液。取上清液0.5 mL 加入甲醇1.5 mL，渦旋60 s 混勻，10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8.6 cm），收集上清液，并在室溫下用氮?dú)獯蹈?。將殘留物重新溶解在甲?00 μL中，10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8.6 cm），取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS系統(tǒng)分析。

2.3 UPLC-MS/MS分析條件

2.3.1 色譜條件 Eclipse Plus C18RRHD 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫為30 ℃，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，5%B；3～15 min，5%～10%B；15～25 min，10%～20%B；25～40 min，20%～40%B；40～45 min，40%～100%B；45～50 min，100%B；50～51 min，100%～5%B；51～60 min，5%B），流速為0.20 mL·min-1，進(jìn)樣體積為5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 正、負(fù)離子模式采集。正離子模式：噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣壓力為15 arb，輔助氣壓力為5 arb，吹掃氣壓力為0 arb，毛細(xì)管溫度為275 ℃，毛細(xì)管電壓為10 V，透鏡電壓為80 V；負(fù)離子模式：噴霧電壓為5000 V，鞘氣壓力為15 arb，輔助氣壓力為5 arb，吹掃氣壓力為0 arb，毛細(xì)管溫度為275 ℃，毛細(xì)管電壓為-10 V，透鏡電壓為-100 V。二級質(zhì)譜用數(shù)據(jù)依賴模式采集，全掃描圖譜中響應(yīng)度最高的3 個峰用于二級質(zhì)譜分析，碰撞氣體為氦氣，碰撞能量為35 eV，全掃描范圍為m/z200～800。

3 結(jié)果與討論

采用UPLC-MS/MS 對松齡血脈康膠囊及灌胃松齡血脈康膠囊后大鼠血漿樣品進(jìn)行檢測分析，松齡血脈康膠囊提取物、大鼠給藥血漿樣品及空白血漿樣品正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖見圖1～2。通過對比松齡血脈康膠囊提取物的質(zhì)譜圖和相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)庫等信息，從松齡血脈康膠囊中初步鑒定出76 個化學(xué)成分，具體信息見表1；從給藥松齡血脈康膠囊的大鼠血清中共鑒定了20 個移行成分，包括9個原型化合物和11個代謝產(chǎn)物，具體信息見表2。

表1 松齡血脈康膠囊成分的UPLC-MS/MS分析

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 大鼠血中移行成分的UPLC-MS/MS分析

圖1 松齡血脈康膠囊、給藥組大鼠血漿和對照組大鼠血漿正離子模式下離子流圖

3.1 松齡血脈康膠囊化學(xué)成分鑒定

3.1.1 通過對照品鑒定的成分 通過與對照品的保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，化合物9、20、23、32、33、42、66、67、71 分別鑒定為兒茶素、(6S,7E,9R)-長壽花苷、葛根素、大豆苷、馬尾松苷B、異落葉松脂素-9′-O-阿拉伯糖苷、馬尾松苷D、芒柄花苷和大豆苷。

圖2 松齡血脈康膠囊、給藥組大鼠血漿和對照組大鼠血漿負(fù)離子模式下離子流圖

3.1.2 通過化合物的裂解規(guī)律并結(jié)合文獻(xiàn)分析鑒定的成分 化合物4、7、10、18、25、27 在正離子模式下給出m/z417，399 碎片離子，在負(fù)離子模式下給出m/z415，295 碎片離子，表明這些化合物為葛根素（23）衍生物。化合物4、10、18 有相似的質(zhì)譜圖，鑒定為葛根素葡萄糖苷衍生物[5-7]。化合物25 和27 在m/z549[M+H]+有相同的分子離子峰，并且二級質(zhì)譜給出m/z417，399，通過與文獻(xiàn)對比，分別鑒定為葛根素木糖苷和葛根素芹糖苷[1]。化合物7 在m/z711[M+H]+和709[M-H]-處顯示分子離子，并在正離子模式下給出m/z565，417，399 碎片離子，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照，鑒定為4′-O-葡萄糖基-葛根素芹菜糖苷[8]。

化合物47、49、50 正離子模式下給出m/z431，413，311 碎片離子，負(fù)離子模式下給出m/z429，309 碎片離子，表明這些化合物為葛根素甲基化衍生物?；衔?0 的分子離子m/z431 [M+H]+和429 [M-H]-，以及正離子模式下碎片離子m/z413[M+H-H2O]+，311[M+H-H2O-C4H6O3]+和負(fù)離子模式下碎片離子309 [M-H-C4H8O4]-，顯示化合物50 為4′-甲氧基葛根素[9]?；衔?7 和49 有相同的分子離子m/z563 [M+H]+，并且二級碎片給出特征離子m/z431，413，通過與文獻(xiàn)對比，分別鑒定為4′-甲氧基-6″-O-木糖葛根素和4′-甲氧基-6″-O-芹糖葛根素[9]。

化合物3、11、13、14、16、17、24、36 正離子模式下給出m/z433，415 碎片離子，負(fù)離子模式下給出m/z431，311 碎片離子，表明這些化合物為葛根素羥基化衍生物?；衔?1和24質(zhì)譜特征為羥基葛根素[1,10]?；衔? 和13 質(zhì)譜特征為羥基葛根素葡萄糖苷[11-12]?；衔?4、17 和36 有相同的分子離子峰m/z565 [M+H]+，并且二級質(zhì)譜給出特征離子m/z433，415，通過與文獻(xiàn)對比，分別鑒定為染料木素-8-C-芹糖葡萄糖苷、3′-羥基-6″-O-木糖葛根素和3′-甲氧基-6″-O-芹糖葛根素[1,13]?；衔?6 分子離子m/z727[M+H]+和725[M-H]-，并且正離子模式下給出m/z595[M+H-Api]+、565[M+H-Glu]+和433 [M+H-Api-Glu]+碎片離子。因此初步鑒定為3′-羥基-4′-O-葡萄糖基-6″-O-芹糖葛根素。

化合物5、26、29、31、65 正離子模式下給出m/z447，429碎片離子，負(fù)離子模式下給出m/z445，325 碎片離子，表明這些化合物為葛根素甲氧化衍生物?；衔?6和31質(zhì)譜特征為甲氧基葛根素[14-15]；化合物5 的分子離子m/z609[M+H]+和碎片離子m/z447，顯示為甲氧基葛根素葡萄糖苷[16]；化合物29和65 有相同的分子離子m/z579[M+H]+和特征碎片離子m/z447，429，通過文獻(xiàn)分別鑒定為3′-甲氧基-6″-O-木糖葛根素和4′,7-二羥基-3′-甲氧基異黃酮8-C-芹糖基-葡萄糖苷[16-17]。

化合物37 分子離子m/z463 [M+H]+和461 [MH]-，以及碎片離子m/z445 [M+H-H2O]+和341[M-H-C4H8O4]-，根據(jù)文獻(xiàn)鑒定為圓錐黃檀亭[18]。

化合物8、30、32、38 產(chǎn)生碎片離子m/z255，表明這些化合物為大豆苷元（71）衍生物。化合物38在丟失葡萄糖基后顯示與化合物32相同的離子碎片m/z255，鑒定為大豆苷元-4′-O-葡萄糖苷[19]?；衔? 和30 分別在m/z579 和549 處產(chǎn)生分子離子[M+H]+，二級質(zhì)譜在m/z255產(chǎn)生碎片離子。通過文獻(xiàn)分析，分別鑒定為大豆苷元-4′,7-二葡萄糖苷和(-)-葛扁豆異黃苷[1,20]。

化合物62、67、69、70 產(chǎn)生碎片離子m/z269，表明這些化合物應(yīng)該是大豆苷元甲基化衍生物?；衔?9與67相比有相同的分子離子和碎片離子，鑒定為異芒柄花苷[21]；化合物62 顯示分子離子m/z563[M+H]+及特征碎片離子m/z431，269，通過文獻(xiàn)查閱暫定為黃甘草苷[22]；化合物70 顯示分子離子m/z461[M+H]+及特征碎片離子m/z299，通過文獻(xiàn)對比鑒定為8-甲氧基芒柄花苷[23]。

化合物6、19、21、22、43、46 產(chǎn)生碎片離子m/z271，表明這些化合物為大豆苷元羥基化衍生物?；衔?1和46有相同的質(zhì)譜特征，被鑒定為羥基大豆苷元葡萄糖苷[1,24]；化合物6 和19 有相同的質(zhì)譜特征，鑒定為羥基大豆苷元葡萄糖苷[25-26]；化合物43 顯示分子離子565 [M+H]+，以及特征碎片離子m/z433，271，通過文獻(xiàn)分析暫定為葛扁豆異黃苷素[27]；化合物22 顯示分子離子m/z727 [M+H]+，產(chǎn)生碎片離子m/z595，565，433，271，因此初步鑒定為葛扁豆異黃苷素-4′-O-葡萄糖苷。

化合物12、34、72、74 產(chǎn)生碎片離子m/z285，表明這些化合物應(yīng)該是大豆苷元甲氧基化衍生物?；衔?4和74相比，失去葡萄糖基后有相同的離子特征，鑒定為甲基大豆苷元葡萄糖苷[28-29]；化合物12 鑒定為甲基大豆苷元雙葡萄糖苷[6]；化合物72 顯示分子離子m/z579[M+H]+、623[M+HCOOH-H]-和577 [M-H]-，并且正離子模式下產(chǎn)生碎片離子m/z447，285，負(fù)離子模式下產(chǎn)生碎片離子m/z283，通過文獻(xiàn)分析暫定為4′,5,7-三羥基-異黃酮-6-甲基醚-7-O-木糖基-葡萄糖苷[30]。

化合物39、52、64、73、78 給出了相同的m/z248 的丟失，表明在這些化合物中應(yīng)該存在6″-O-丙二酰葡萄糖基。化合物39、52、64、73、78 分別在m/z519，533，519，517，533處產(chǎn)生分子離子[M+H]+，二級質(zhì)譜中失去6″-O-丙二酰葡萄糖基后，分別在m/z271，285，271，269，285 處產(chǎn)生碎片離子，通過查閱文獻(xiàn)分別鑒定為染料木素-4′-(6″-O-丙二酰葡萄糖苷)、6″-O-丙二酰染料木苷、6″-O-丙二酰染料木素、6″-O-丙二酰芒柄花苷、6″-O-丙二酰鷹嘴豆芽素A[10,31-32]。

化合物60、61、77 給出了相同的m/z204 的丟失，表明在這些化合物結(jié)構(gòu)中應(yīng)該存在6″-O-乙酰葡萄糖基?；衔?0、61、77 分別在m/z459，507，473處產(chǎn)生分子離子[M+H]+，二級質(zhì)譜中失去6″-O-乙酰葡萄糖基后，分別在m/z259，303，269 處產(chǎn)生碎片離子，通過查閱文獻(xiàn)分別鑒定為6″-O-乙酰大豆苷、6″-O-乙酰異槲皮苷和6″-O-乙酰芒柄花苷[6,23,33]。

化合物45 在m/z637 [M+H]+處顯示分子離子，由于葡萄糖基的丟失，其在m/z475[M+H-Glu]+處產(chǎn)生碎片離子，并且在m/z313 處產(chǎn)生與化合物63相同的離子。通過查閱文獻(xiàn)分別鑒定為葛根苷B 和葛根苷C[34]。

化 合 物15[35]、28[36]、35[3]、40[3]、44[37]、48[3]、51[38]、53[39]、54[40]、57[41]、58[42]、59[4]、68[43]、75[3]、76[3]和79[3]根據(jù)各自的分子離子和碎片離子特征鑒定結(jié)果見表1。

3.2 大鼠血漿中移行成分鑒定

3.2.1 大鼠血漿中原型成分的鑒定 通過比較給藥組大鼠血漿與空白對照組大鼠血漿和松齡血脈康膠囊組的保留時間和質(zhì)譜特征，9 個化合物被認(rèn)為是松齡血脈康膠囊的原型成分，分別鑒定為葛根素（23）、染料木素-8-C-葡萄糖苷（24）、3′-甲氧基葛根素（26）、米里菲菌素（27）、β-谷甾醇（28）、大豆苷（32）、大豆苷元-4′-O-葡萄糖苷（38）、4′-甲氧基-6′-O-芹菜酰葛根素（49）和4′-甲氧基葛根素（50）。結(jié)果顯示，在給予松齡血脈康膠囊提取物后，可從大鼠血漿中明確地檢測到異黃酮類化合物原型。

3.2.2 大鼠血漿中代謝產(chǎn)物的鑒定 為了準(zhǔn)確鑒定代謝物，首先對藥物在體內(nèi)的代謝規(guī)律進(jìn)行分析。如上所述，異黃酮是松齡血脈康膠囊的主要成分，其主要的代謝途徑是葡萄糖醛酸化、硫酸酯化和甲基化。在質(zhì)譜特征中m/z176的丟失在結(jié)構(gòu)上可歸為葡糖醛酸基團(tuán)，如M2～M6 和M8～M11，m/z80 的丟失可被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)中的磺化基團(tuán)，如M1 和M7。以上述鑒定的松齡血脈康膠囊成分為基礎(chǔ)，大鼠血漿中代謝產(chǎn)物鑒定如下。

代謝物M2和M3在m/z431[M+H]+和429[M-H]-產(chǎn)生相同的分子離子。并且在正離子模式下都有m/z255的碎片離子，推測結(jié)構(gòu)為大豆苷元的葡萄糖醛酸衍生物[44-45]。

代謝物M5 和M8 在m/z461 [M+H]+和459 [MH]-產(chǎn)生相同的分子離子。且在正離子模式下都有m/z285 的碎片離子，推測化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為黃豆黃素葡萄糖醛酸酯和甲氧基大豆苷元葡萄糖醛酸酯[46]。

同理M9～M11根據(jù)各自的分子離子和碎片離子特征鑒定結(jié)果見表2。

代謝物M6 的分子離子為m/z447 [M+H]+、445[M-H]-，并且在正離子模式下給出m/z271 的碎片離子，推測結(jié)構(gòu)為染料木素葡萄糖醛酸酯[47]。代謝物M1 負(fù)離子模式下的分子離子m/z495[M-H]-和碎片離子m/z415，253 顯示M1 為大豆苷硫酸酯[48]。代謝物M7負(fù)離子模式下的分子離子m/z333[M-H]-和碎片離子253[M-H-80]-，推測M7 為大豆黃素硫酸酯[49]。

4 結(jié)論

鮮松葉為松齡血脈康膠囊的君藥，但在本研究中松齡血脈康膠囊含藥血清中未能發(fā)現(xiàn)鮮松葉特征來源的化合物，可能是由于鮮松葉中存在較多揮發(fā)油成分和大極性成分，在UPLC-MS/MS 中不易表征。對于這些成分還需采用其他適合的方法來進(jìn)行進(jìn)一步分析和鑒定。本研究通過UPLC-MS/MS 快速分析鑒定了松齡血脈康膠囊的76 個化學(xué)成分和20 個入血移行成分，包括9 個原型成分和11 個代謝物。初步揭示了松齡血脈康膠囊潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為松齡血脈康膠囊作用機(jī)制的研究提供了參考。