三棱UPLC-UV特征圖譜研究△

唐嵩媛，趙琦琦，孫暉*，閆廣利*，王喜軍，車延檸，張秀玲

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)/教育部經(jīng)典名方有效性評價及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱中藥四廠有限公司，黑龍江 哈爾濱 150500

三棱為黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖，味辛、苦，性平，歸肝、脾二經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛的功效，用于癥瘕痞塊、痛經(jīng)、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛、食積脹痛[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)疏》記載：“三棱，從血藥則治血，從氣藥則治氣，能治一切凝結(jié)停滯之堅積也?！盵2]《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》記載：“三棱、莪術(shù)為化瘀血之要藥，化血之力三棱優(yōu)于莪術(shù)，理氣之力莪術(shù)優(yōu)于三棱?！盵3]現(xiàn)代藥理研究表明，三棱具有抑制血小板聚集及抗血栓、抗動脈粥樣硬化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化等作用[4]。三棱的化學(xué)成分復(fù)雜，目前已分離鑒定的化合物主要包括苯丙素、有機酸、黃酮、甾體、蒽醌、生物堿、揮發(fā)油、二苯基庚烷、脂肪酸等類成分[5]。然而，三棱功效相關(guān)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確，導(dǎo)致目前仍沒有建立有效的三棱質(zhì)量控制方法，《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）三棱藥材項下僅有性狀、顯微和薄層鑒別，無明確的成分定性、定量檢測標(biāo)準(zhǔn)[1]，難以保障其臨床療效。

由于三棱藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，對化學(xué)成分進(jìn)行整體表征是控制其質(zhì)量的必要手段。指紋圖譜/特征圖譜是中藥整體質(zhì)量控制的有效方法，現(xiàn)已作為中藥注射劑[6]、中藥配方顆粒[7]、古代經(jīng)典名方復(fù)方制劑[8]、中藥創(chuàng)新藥[9]的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項目，以及作為上市品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制的重要研究內(nèi)容[10]。三棱的指紋圖譜已有報道[11-14]，然而其檢測的共有峰或特征峰均為香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、對香豆酸等極性有機酸類成分。該類成分雖然具有一定生物活性，但其在藥用植物中廣泛存在，仍需要增加三棱特征成分的檢測，以增強其專屬性和質(zhì)量控制的有效性。本研究系統(tǒng)考察色譜分離和紫外光譜檢測條件，建立能夠表征三棱藥材更多結(jié)構(gòu)類型化學(xué)成分的特征圖譜，為三棱藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供新的方法。

1 材料

ACQUITY 型超高效液相色譜儀，配備光電二極管陣列（PDA）檢測器和Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；AE-240 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DA 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

色譜純乙腈（美國Fisher 公司）；色譜純磷酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司]；色譜純甲醇（美國Dikma公司）；水為超純水；10批三棱藥材，產(chǎn)地為浙江磐安，批號分別為170101、170102、170103、170104、170105、170106、170107、170108、170109、1701010，均由哈爾濱中藥四廠有限公司提供；對照品咖啡酸（批號：11085-201703，純度：99.7%）、阿魏酸（批號：110773-201915，純度：99.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品對香豆酸（批號：21052604，純度：99.97%）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～20%A；5～6 min，20%～35%A；6～10 min，35%A；10～12 min，35%～50%A；12～15 min，50%～75%A；15～16 min，75%～100%A）；檢測波長：0～12 min為300 nm，12～16 min為240 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積：3 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取三棱粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入75%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（頻率50 kHz，功率250 W），放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取對照品咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸適量，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.667、1.017、1.305 μg·mL-1的對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結(jié)果測得各共有峰相對保留時間的RSD 均小于1.0%，相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 精密稱定三棱粉末，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，考察色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結(jié)果測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于1.0%，相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱定三棱粉末，按2.2 項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12 h 后按2.1 項下色譜條件采集色譜圖，考察色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結(jié)果測得各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD 均小于3.0%，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）計算，測得色譜指紋圖譜與其所得的共有模式圖的相似度均為1.000，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 特征圖譜的建立及相似度評價

取10 批三棱藥材樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件采集色譜圖，得10批三棱的超高效液相色譜-紫外法（UPLC-UV）圖譜。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）進(jìn)行色譜峰匹配，選擇中位數(shù)法及多點校正法生成對照圖譜（圖1）。選擇色譜圖中分離度較好、峰強度適中的共有色譜峰作為特征峰，共標(biāo)定11 個共有特征峰，按出峰時間依次標(biāo)記為1～11號峰。峰4 經(jīng)對照品比對認(rèn)定為對香豆酸，該峰峰面積適中，保留時間穩(wěn)定，以其作為參照峰（S），規(guī)定其他峰的相對保留時間：峰1 為0.42 min，峰2為0.77 min，峰3為0.95 min，峰4為1.00 min，峰5為1.07 min，峰6 為1.23 min，峰7 為1.52 min，峰8 為1.59 min，峰9 為1.63 min，峰10 為2.01 min，峰11 為2.64 min。計算各批三棱藥材特征圖譜與對照圖譜的相似度，結(jié)果表明，10 批三棱藥材特征圖譜的相似度分別為0.969、0.991、0.915、0.972、0.967、0.977、0.987、0.987、0.954、0.985，表明10批三棱藥材批次間穩(wěn)定性良好。

圖1 10批三棱藥材的UPLC-UV圖（S1～S10）及對照指紋圖譜（R）

2.6 特征峰認(rèn)定

為考察特征圖譜是否具有代表性，通過對照品比對和質(zhì)譜解析的方法對三棱藥材主要特征峰進(jìn)行認(rèn)定。按照三棱藥材特征圖譜分析條件采集咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸的色譜圖，通過比較保留時間和紫外光譜圖，認(rèn)定2號峰為咖啡酸，4號峰為對香豆酸，5號峰為阿魏酸，見圖2。

圖2 代表性三棱藥材UPLC-UV特征圖譜及混合對照品色譜圖

由于難以獲得其他三棱成分的對照品，本研究利用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q/TOF-MS）對上述三棱指紋圖譜的共有峰進(jìn)行認(rèn)定。色譜條件參照2.1 項，僅用甲酸代替磷酸，即0.1%甲酸水-乙腈作為流動相，其他參數(shù)相同。質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子源，負(fù)離子檢測模式下，毛細(xì)管電壓為2.5 kV；錐孔提取電壓為3.0 V；去溶劑氣溫度為350 ℃；去溶劑氣體積流量為700 L·h-1；錐孔氣體積流量為50 L·h-1；離子源溫度為110 ℃；相對分子質(zhì)量檢測范圍m/z50～1200。測得三棱藥材UPLC-Q/TOF-MS 總離子流色譜圖，與三棱UPLC-UV 指紋圖譜比較，根據(jù)相對保留時間確定總離子流色譜圖中對應(yīng)的指紋圖譜共有峰，見圖3。由于峰1和峰3在總離子流色譜圖中峰強度較低，而且受其他峰干擾，不能進(jìn)行認(rèn)定。采集峰6～11的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息，利用一級質(zhì)譜圖提供的準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量和同位素峰比例，計算分子式。在三棱藥材已知化學(xué)成分中匹配與該分子式一致的化合物，進(jìn)一步通過解析二級質(zhì)譜的裂解途徑，對匹配的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗證，從而進(jìn)行峰認(rèn)定，結(jié)果見表1。

表1 三棱特征圖譜特征峰的UPLC-Q/TOF-MS分析結(jié)果

圖3 三棱藥材UPLC-Q/TOF-MS總離子流色譜圖

峰6 準(zhǔn)分子離子m/z685.198 4 [M-H]-，計算分子組成為C30H37O18，與三棱中含有的已知化學(xué)成分β-D-(O-乙酰基-O-阿魏?；?呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷[15-18]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z193、175、160 的碎片離子，推測裂解途徑見圖4。三棱中含有該結(jié)構(gòu)果糖上3 位、6 位阿魏?；〈漠悩?gòu)體和葡萄糖上2′、3′、4′、6′位乙?；〈漠悩?gòu)體，僅通過二級質(zhì)譜不能確定準(zhǔn)確的取代位置，因此，初步鑒定峰6為β-D-(O-乙?；?O-阿魏?；?呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷。

圖4 β-D-(O-乙酰基-O-阿魏?；?呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰7 準(zhǔn)分子離子m/z383.114 0 [M-H]-，計算分子組成為C21H19O7，與三棱中含有的已知化學(xué)成分1,3-O-二-對-香豆?；视王19]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z229、211、171 的碎片離子，推測裂解途徑見圖5。因此，峰7 初步鑒定為1,3-O-二-對-香豆?；视王?。

圖5 1,3-O-二-p-香豆酰基甘油酯的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰8 準(zhǔn)分子離子[M-H]-m/z413.125 8，計算分子組成為C22H21O8，與三棱中含有的已知化學(xué)成分1-O-阿魏?；?3-O-p-香豆?；视王19]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z193、177、163、145、134、119的碎片離子，推測裂解途徑見圖6，因此，峰8初步鑒定為1-O-阿魏?；?3-O-p-香豆酰基甘油酯。

圖6 1-O-阿魏?；?3-O-p-香豆?；视王サ亩壻|(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰9 準(zhǔn)分子離子m/z443.134 9 [M-H]-，計算元素組成為C23H23O9，與三棱中含有的已知化學(xué)成分1,3-O-二阿魏酰基甘油酯[19]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z193、175、134 的碎片離子，推測裂解途徑見圖7，因此，峰9初步鑒定為1,3-O-二阿魏?；视王ァ?/p>

圖7 1,3-O-二阿魏?；视王サ亩壻|(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰10 準(zhǔn)分子離子m/z861.224 9[M-H]-，計算分子組成為C40H45O21，與三棱中含有的已知化學(xué)成分β-D-(1-O-乙酰基-3,6-O-二阿魏?；?呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷[19]分子式一致。二級質(zhì)譜給出m/z819（脫乙?；?01（脫H2O）、193、175、160 的碎片離子，推測裂解途徑見圖8。三棱中含有該結(jié)構(gòu)葡萄糖基上2′、3′、4′、6′位乙?；〈漠悩?gòu)體，僅通過二級質(zhì)譜不能確定準(zhǔn)確的取代位置，因此，峰10初步鑒定為β-D-(1-O-乙酰基-3,6-O-二阿魏?；?呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷。

圖8 β-D-(1-O-乙?；?3,6-O-二阿魏?；?呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

峰11 準(zhǔn)分子離子m/z295.227 7[M-H]-，計算分子組成為C18H31O3，三棱中未發(fā)現(xiàn)與該分子式一致的已知化學(xué)成分。二級質(zhì)譜如圖9 所示，可見分子離子脫去H2O，產(chǎn)生m/z277.217 2 碎片離子，而未見分子離子脫去CO2的碎片離子，推測該化合物含有1 個醇羥基，而不含羧基，不是脂肪酸類化合物。該分子離子中性丟失C9H16產(chǎn)生元素組成為C9H15O3的m/z171.102 3碎片離子。推測C1～C9存在2個雙鍵，并有3 個氧取代位；由C9H16的中性丟失，推測該化合物C10～C18 不含氧原子而且含有1 個雙鍵。由于在C9-C10 鍵斷裂，同時C11 上1 個H 轉(zhuǎn)移到C9，使C10-C11 形成雙鍵，這樣能夠與C12-C13 雙鍵形成穩(wěn)定的共軛體系，因此推測C10～C18鏈上雙鍵位于C12-C13。該化合物分子離子還產(chǎn)生m/z195.138 4 碎片離子，計算分子組成為C12H19O2，為分子離子中性丟失C6H12O 的離子；C6H12O 的中性丟失含有1 個雙鍵，為C6-C7 鍵斷裂時C5 上H 轉(zhuǎn)移至C7 后形成C5=C6 雙鍵，由此推測該化合物分子C1～C6 沒有雙鍵，那么另2 個雙鍵存在于C7～C9；m/z195.138 4 碎片離子分子式C12H19O2，而C10～C18 不含氧原子，推測C7～C9 有2 個氧原子，那么C7～C9 的結(jié)構(gòu)為-CO-HC=COH-或-COH=CH-CO-，此結(jié)構(gòu)為穩(wěn)定的共軛體系，其兩端的C-C 鍵容易斷裂，從而在二級質(zhì)譜上產(chǎn)生中性丟失C9H16、C6H12O 的碎片離子。以-CO-HC=COH-結(jié)構(gòu)說明該化合物的裂解途徑見圖9。該化合物結(jié)構(gòu)與三棱酸相似，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)含有烯酮結(jié)構(gòu)，故暫稱其為三棱酮。

圖9 三棱酮的二級質(zhì)譜圖及裂解途徑解析過程

3 討論

三棱化學(xué)成分復(fù)雜，包括苯丙素、有機酸、黃酮、甾體、蒽醌、生物堿、揮發(fā)油、二苯基庚烷、環(huán)二肽、脂肪酸等類化學(xué)成分[5]，然而已報道的三棱化學(xué)成分指紋圖譜僅表征了香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、對香豆酸等大極性有機酸類成分[11-13]，主要原因是僅采用254 nm 或300 nm 的檢測波長，不能兼顧多種紫外吸收特征的成分。本研究利用PDA 檢測器，在200～400 nm 波長采集三棱供試品溶液色譜圖，經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)0～12 min 的色譜圖在300 nm 波長下色譜峰信息比較豐富，峰形良好，而在12～16 min 的色譜圖在240 nm 波長下可檢測到很強的色譜峰，即11 號峰。因此，本研究采用雙波長切換掃描的方式采集三棱指紋圖譜，0～12 min 在300 nm 波長采集，12～16 min 在240 nm 采集，從而能夠采集到更全面的三棱化學(xué)成分峰。

為說明本研究所建立的特征圖譜能夠表征三棱的主要化學(xué)成分，進(jìn)一步利用對照品和UPLC-Q/TOF-MS 對三棱特征圖譜的特征峰進(jìn)行了認(rèn)定。與以往文獻(xiàn)報道的三棱指紋圖譜不同，本研究建立的特征圖譜除了表征阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸等極性有機酸類成分，還表征了苯丙素乙酰蔗糖酯、苯丙素甘油酯及一個十八碳烯酮成分（三棱酮），表明該指紋圖譜能夠更全面控制三棱藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)。三棱具有破血行氣、消積止痛的功效，是活血化瘀要藥，具有抗血小板凝集和抗血栓作用、抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[2]，三棱抗癌和心血管方面的活性相關(guān)部位是以苯丙素類成分為主的小極性部位[20]，而本研究建立的特征圖譜中峰6～10 均屬于小極性苯丙素類成分，說明本特征圖譜表征了藥效相關(guān)成分，而以往的三棱指紋/特征圖譜中均未表征該類成分。另外，本研究利用UPLC-Q/TOF-MS 技術(shù)鑒定峰11 為一種十八碳烯酮，暫稱為三棱酮，該化合物峰強度高、含量穩(wěn)定，可代表三棱高級脂肪族化合物。因此，本研究建立的三棱UPLC-UV特征圖譜除了表征大極性的有機酸成分外，還能夠表征小極性苯丙素酯類成分及脂肪族化合物，能夠更有效地控制三棱藥材質(zhì)量。

4 結(jié)論

本研究建立了中藥三棱UPLC-UV特征圖譜，確定11個特征峰及對照圖譜，利用對照品認(rèn)定了咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸的特征峰，利用UPLC-Q/TOF-MS 鑒定了5 個苯丙素酯類成分特征峰和1 個脂肪族化合物。該指紋圖譜更全面地表征了三棱主要化學(xué)成分，為三棱藥材質(zhì)量控制提供了新的方法。