鉤藤堿的超聲輔助提取及其含量變化

吳順 孫健鵬 謝麗霞 陳澤陽 張嘉桐 顏彬彬

摘要 [目的]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選鉤藤堿最佳提取工藝，確定鉤藤藥材最佳采收時期。[方法]以傳統(tǒng)外觀質(zhì)量和鉤藤堿含量為評價指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比、乙醇質(zhì)量濃度和超聲處理時間為影響因素，采用L16（43）正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝。通過檢測不同采收時期鉤藤堿含量的變化，確定最佳采收時期。[結(jié)果]鉤藤堿最佳提取工藝為料液比1∶20，60%乙醇浸泡1 h，超聲處理40 min，80 ℃回流2 h;當(dāng)年10月—次年2月為鉤藤藥材的較佳采收時期。[結(jié)論]優(yōu)選出的鉤藤堿提取工藝設(shè)計合理、結(jié)果可靠;確定了鉤藤藥材的采收時期，為利用湖南鉤藤進(jìn)行飲片生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 鉤藤;超聲提取;鉤藤堿;含量;采收時期

中圖分類號 R 284? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）12-0158-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.040

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Ultrasound-assisted Extraction and Its Content Changes of Rhynchophylline

WU Shun， SUN Jian-peng， XIE Li-xia et al

（School of Life Science and Technology， Central South University of Forestry and Technology， Changsha，Hunan 410018）

Abstract [Objective]The optimal extraction conditions for rhynchophylline from Uncaria tenuifolia were investigated by orthogonal tess method，the optimal harvesting season for crude drugs was confirmed. [Method] Taking traditional appearance quality and rhynchophylline content as evaluation indicators，on the basis of single factor experiment， taking the solid-liquid ratio， ethanol mass concentration and ultrasonic treatment time as influencing factors， L16（43） orthogonal design was adopted to optimize the extraction process.The optimum harvesting period was determined by detecting the changes of rhynchophylline content in different harvesting periods.[Result]The optimal extraction process of rhynchophylline was as follows： solid-liquid ratio of 1∶20， soaking in 60% ethanol for 1 h， ultrasonic treatment for 40 min， and reflux at 80 ℃ for 2 h.The better harvesting time for Uncaria tenuifolia medicinal materials was from the year October to February of the following year. [Conclusion]The selected extraction condition for rhynchophylline was reasonable and dependable;the harvesting season for Uncaria tenuifolia medicinal materials was confirmed and provided the theoretical basis for production of Chinese herbal medicine in Uncaria tenuifolia.

Key words Uncaria tenuifolia;Ultrasonic extraction;Rhynchophylline;Content;Harvesting time

鉤藤為茜草科植物鉤藤[Uncaria rhynchophylla（Miq.）Jacks]的干燥帶鉤莖枝，具有清熱平肝、熄風(fēng)定驚等功效[1]。研究表明，鉤藤中的有效成分主要有生物堿類、黃酮類、有機(jī)酸類、甾體類、苷類化合物，具有顯著的降壓、鎮(zhèn)靜、安眠、解痙等作用，其中具有顯著藥理作用的主要是以鉤藤堿為代表的吲哚類生物堿，臨床上主要治療高血壓、癲癇、哮喘等疾病，如方劑羚角鉤藤湯、麻黃鉤藤散、天麻鉤藤飲、瀉肝安神湯等[2-5]。

鉤藤生長環(huán)境中的溫度、水分、光照、大氣、鹽分、養(yǎng)分等都會使其在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上發(fā)生變化以適應(yīng)環(huán)境，而次生物質(zhì)則是它適應(yīng)環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)。鉤藤堿作為鉤藤的次生代謝產(chǎn)物，其合成和積累會隨著季節(jié)的變化而變化[6-8]。該研究以鉤藤堿為考察對象，采用正交試驗(yàn)法結(jié)合超聲處理對鉤藤帶鉤枝條中的鉤藤堿進(jìn)行提取，旨在獲得最佳提取工藝;同時，通過采集湖南不同月份的鉤藤藥材，闡明其有效成分鉤藤堿的動態(tài)積累規(guī)律，為更好地利用鉤藤藥材進(jìn)行飲片生產(chǎn)具有重要意義。C1D07F86-5081-46E3-9087-D860B7D909FA

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 2015年3月種植于中南林業(yè)科技大學(xué)試驗(yàn)基地的黔鉤藤。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A）;超聲洗脫儀（SBZ200）;真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-25C）。鉤藤堿（純度為98%）標(biāo)準(zhǔn)樣品購自上海源葉生物科技有限公司。流動相所用甲醇為色譜純，試驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。

1.3 樣品的采集與干燥

2018—2020年每月15日左右在試驗(yàn)基地采集當(dāng)年生帶鉤枝條，共36批。用40 ℃恒溫干燥，直至恒重。將干燥后的帶鉤莖枝分別粉碎過40目篩，備用。

1.4 提取條件的選擇

將鉤藤生物堿的初始工藝參數(shù)設(shè)定為乙醇質(zhì)量濃度60%、超聲處理時間30 min、提取溫度80 ℃，并固定料液比1∶20（g∶mL）、超聲功率300 W。精確稱取樣品，加入乙醇溶液后，浸泡1 h。置于80 ℃水浴中回流2 h，3 000 r/min，取上清液，真空干燥。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察超聲處理時間（10、20、30、40、50、60 min）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）和乙醇質(zhì)量濃度（10%、20%、40%、60%、80%、90%）對鉤藤粉末中鉤藤生物堿提取量的影響，重復(fù)3次。固定每次優(yōu)化的最佳提取條件，再一次按順序優(yōu)化篩選其余條件。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以鉤藤堿含量為評價指標(biāo)，選取料液比（A）、乙醇質(zhì)量濃度（B）、超聲時間（C）為考察因素，按照L16（43）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個因素取4個水平，考察最佳提取條件。

1.5 色譜條件

參照黃瑞松等[7]的方法。色譜柱為Waters C18（3.9 mm×150 mm，5 μm）;流動相為甲醇-水（含0.002 mol/L三乙胺，用冰醋酸調(diào)pH至7.5）（64∶36）;柱溫40 ℃;流速1 mL/min;檢測波長254 nm，進(jìn)樣量5 μL。

1.6 供試品中鉤藤堿含量的測定

精密稱取供試品按照正交試驗(yàn)優(yōu)化條件進(jìn)行提取制備，并按“1.5”色譜條件進(jìn)行鉤藤堿含量測定。

1.7 提取物中鉤藤堿含量的計算

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的鉤藤提取物，溶解并定容至25 mL，樣品進(jìn)行高效液相色譜檢測。按公式w=C×10×YM×1 000進(jìn)行含量計算，式中，w為粗品中鉤藤堿含量（μg/g），C為稀釋后溶液質(zhì)量濃度（μg/g），Y為稀釋倍數(shù)，M為鉤藤堿粗品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉤藤堿的高效液相色譜檢測

精確稱取鉤藤堿對照品和檢測樣品適量，加75%甲醇制成約25 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測液。按“1.5”色譜條件上樣，結(jié)果顯示（圖1），待測樣品獲得了較好的分離，所得峰型完整，無雜質(zhì)峰干擾，保留時間在11.5 min左右。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲時間的選擇。以1∶20料液比加入60%乙醇，浸泡1 h后，超聲處理一定時間，80 ℃水浴中回流2 h。由圖2可知，隨著超聲處理時間的增加，鉤藤提取物中鉤藤堿含量隨之升高?？梢姺磻?yīng)時間越長，提取越充分，但是當(dāng)超聲時間超過40 min時，提取物中鉤藤堿含量趨于穩(wěn)定，增長較小?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的效益，因此選定處理時間20、30、40、50 min作為正交試驗(yàn)的4個水平。

2.2.2

料液比的選擇。以不同料液比加入60%乙醇，浸泡1 h后，超聲處理30 min，在80 ℃水浴中回流2 h。由圖3可知，料液比在1∶5～1∶30時，隨著溶劑用量的增加鉤藤提取物中鉤藤堿含量呈增大趨勢，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30后鉤藤提取物中鉤藤堿含量反而降低。這表明隨著溶劑用量的增加，降低了提取物中有效成分的濃度，不利于工業(yè)生產(chǎn)。因此，選定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40作為正交試驗(yàn)的4個水平。

2.2.3

乙醇質(zhì)量濃度的選擇。由圖4可知，乙醇質(zhì)量濃度為20%～80%時，鉤藤提取物中鉤藤堿含量較高，乙醇質(zhì)量濃度為60%時達(dá)到最高，大于80%后，鉤藤提取物中鉤藤堿含量明顯下降。由此可見，提取過程中乙醇質(zhì)量濃度必須適當(dāng)，過高和過低均會對鉤藤提取物中鉤藤堿含量造成影響，且過高會增加提取成本。因此選定20%、40%、60%、80%作為正交試驗(yàn)的4個水平。

2.3 鉤藤堿提取工藝的正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得出正交試驗(yàn)的因素和水平（表1）。

根據(jù)高效液相色譜檢測計算出鉤藤提取物中鉤藤堿含量，運(yùn)用SPSS 10.0對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計比較分析，獲得鉤藤堿正交最佳提取工藝。由表2可知，影響鉤藤堿提取的因素大小依次是C>B>A，但均達(dá)到顯著水平。鉤藤堿最佳提取工藝為A2B3C3，即料液比1∶20，60%乙醇浸泡1 h，超聲處理40 min，80 ℃回流2 h。正交試驗(yàn)方差分析表明，按工藝條件進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重現(xiàn)性較好。

2.4 鉤藤不同采收期鉤藤堿變化

據(jù)觀察，試驗(yàn)基地中的鉤藤在每年3月中旬隨著氣溫的升高，逐漸脫離休眠狀態(tài)，4月初開始發(fā)出新芽，5—10月為快速生長時期，10月底枝葉開始變成墨綠，為越冬作準(zhǔn)備。

由圖5可知，鉤藤中鉤藤堿的含量在一年中呈動態(tài)變化，雖然不同年份表現(xiàn)不同，但總體上來看，都以當(dāng)年10月—次年2月采集的樣品中鉤藤堿含量較高，而7—8月樣品中鉤藤堿含量較低。但從不同年份來看，供試品中鉤藤堿含量在不同月份中表現(xiàn)不一，這表明氣候條件對鉤藤體內(nèi)次生物質(zhì)的積累有較大影響。

3 討論與結(jié)論

鉤藤生物堿主要為吲哚類生物堿，易溶于氯仿、丙酮、乙醇、苯等溶劑[9-10]，相對于其他有機(jī)溶劑，乙醇具有廉價、無毒、安全性高的特點(diǎn)，因此該試驗(yàn)選用乙醇作為提取溶劑。超聲波輔助溶劑萃取具有快速、價廉、高效和環(huán)保等優(yōu)勢，可以大大縮短提取時間，提高成分提取率。由于此法提取溫度相對較低，對某些遇熱不穩(wěn)定、易水解或氧化的中藥成分具有較好的保護(hù)作用，因而應(yīng)用范圍較廣。該研究正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳提取工藝為料液比1∶20，60%乙醇浸泡1 h，超聲處理40 min，80 ℃回流2 h，能獲得較高含量的鉤藤堿提取物，為指導(dǎo)鉤藤相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了科學(xué)理論依據(jù)。C1D07F86-5081-46E3-9087-D860B7D909FA

鉤藤作為一種常綠灌木植物，其藥用價值早已得到廣泛認(rèn)可，而關(guān)于采收時間則有不同的記載。從前人的研究成果[11-15]來看，不同產(chǎn)地的鉤藤，為獲得有效成分含量較高的成品藥材，其采收時期存在較大的差異。究其原因，可能是由于植物生長的生態(tài)環(huán)境（如光照、溫度、水分等）對有效成分的形成和積累具有較明顯的影響所致。從該研究的結(jié)果來看，黔鉤藤引種至湖南后，氣候?qū)ζ溆行С煞钟幸欢ǖ挠绊?，但不同年份的變化并不顯著，而其采收期則以當(dāng)年10月—次年2月為最佳。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：257.

[2] 辛文波，侴桂新，王崢濤.鉤藤生物堿類成分研究[J].中草藥，2009，40（2）：204-207.

[3] 于瀟，祝琳琳，劉婕，等.鉤藤中單萜吲哚類生物堿成分及其藥理活性的研究進(jìn)展[J].中草藥，2021，52（19）：6052-6065.

[4] QIN Q J，CUI L Q，LI P，et al.Rhynchophylline ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury through the modulation of mitochondrial mechanisms to mediate myocardial apoptosis[J].Mol Med Rep，2019，19（4）：2581-2590.

[5] LIN C M，LIN Y T，LEE T L，et al.In vitro and in vivo evaluation of the neuroprotective activity of Uncaria hirsuta Haviland[J].J Food Drug Anal，2020，28（1）：147-158.

[6] 胡春鳳，甘光標(biāo).環(huán)境因子對耐蔭藥用植物生長發(fā)育及有效成分影響的研究進(jìn)展[J].南方園藝，2012，23（1）：53-56.

[7] 黃瑞松，黃必奎，張鵬，等.廣西不同產(chǎn)地及不同時期無柄果鉤藤中鉤藤堿含量分析[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，28（5）：674-677.

[8] 王盟，商林林，劉衛(wèi).不同產(chǎn)地及不同采收期鉤藤中異鉤藤堿的含量分析[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2015，37（5）：443-445.

[9]

王瑞儉，孫廣仁，孫寶民.鉤藤堿提取工藝研究[J].吉林林學(xué)院學(xué)報，1998，14（2）：109-111.

[10] 張華，李姍.鉤藤生物堿提取工藝研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2017，13（7）：36-38.

[11] 朱意麟，張鵬， 黃瑞松，等.不同時期攀莖鉤藤鉤藤堿成分的動態(tài)積累分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（6）：48-50.

[12] 徐東升，高言明，楊春，等.毛鉤藤不同采收期總生物堿含量變化研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2015，29（3）：13-14，17.

[13] 王克英，郭思妤，祝晶，等.黔產(chǎn)鉤藤藥材不同采收期及不同加工方法有效成分含量對比研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2012，21（13）：27-28.

[14] 黃瑞松，覃冬杰，張鵬，等.廣西不同產(chǎn)地和不同采收期大葉鉤藤中鉤藤堿定量分析[J].中草藥，2012，43（1）：178-181.

[15] 徐東升，高言明，楊春，等.不同采收期毛鉤藤藥材中鉤藤堿等3種成分的含量變化研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（6）：1478-1479.C1D07F86-5081-46E3-9087-D860B7D909FA