嗜堿纖維素分解細(xì)菌的篩選?鑒定及酶活分析

張?jiān)戒h 呂玲玲 張海沈 王開(kāi)權(quán)

摘要 [目的]從新疆某棉漿廢水生化處理系統(tǒng)中分離具有纖維素分解能力的耐堿細(xì)菌，分析其物種多樣性及纖維素分解酶活性，為生物法處理堿性、纖維素含量高的廢水提供菌株。[方法]采用4種特異性堿性培養(yǎng)基分離耐堿細(xì)菌，采用剛果紅染色法對(duì)其中纖維素分解菌進(jìn)行篩選，通過(guò)16S rRNA基因序列分析和生理生化試驗(yàn)對(duì)纖維素分解細(xì)菌進(jìn)行初步分類(lèi)鑒定，采用DNS法對(duì)其進(jìn)行酶活測(cè)定。[結(jié)果]從各類(lèi)樣品中分離出50株耐堿細(xì)菌，篩選出12株纖維素分解細(xì)菌，其中有7株芽孢桿菌（Bacillus）、2株涅斯捷連科氏菌（Nesterenkonia）、1株耐鹽短桿菌（Brevibacterium halotolerans）、1株假單胞菌（Pseudomonas）、1株另類(lèi)希滅氏菌（Alishewanella），大部分菌株的最適pH為11～12，且具有良好的耐鹽性和纖維素分解酶活力。菌株49228和49239分別與Nesterenkonia flava CAAS 251（T）、Pseudomonas indoloxydans IPL-1（T）的最大相似性為97.71%和98.5%，疑似為潛在的新物種。[結(jié)論]該結(jié)果初步明確了棉漿廢水生化處理系統(tǒng)中的堿性細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)種群，嗜堿纖維素分解菌的獲得可為生化法處理纖維素含量高的堿性廢水處理提供優(yōu)勢(shì)菌株。

關(guān)鍵詞 棉漿廢水;纖維素分解細(xì)菌;篩選;鑒定;嗜堿細(xì)菌;酶活分析

中圖分類(lèi)號(hào) Q93? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）12-0016-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.004

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Screening，Identification and Enzymatic Activity Analysis of Alkalophilic Cellulose Decomposing Bacteria

ZHANG Yue-feng1，L Ling-ling1，ZHANG Hai-shen2 et al

（1.College of Agriculture and Food Engineering，Baise University，Baise，Guangxi 533000;2.College of Life Sciences，Tarim University，Alar，Xinjiang 843300）

Abstract [Objective]To isolate alkali-resistant bacteria with cellulose decomposition ability from some samples of a cotton pulp wastewater biochemical treatment system in Xinjiang，and analyze their species diversity and cellulose decomposition enzyme activities，these strains could be used for biological treatment of wastewater with high alkaline and cellulose content.[Method]Four kinds of specific alkaline media were used to isolate alkali-tolerant bacteria，Congo red staining were used to screen the cellulolytic strains，and 16S rRNA gene sequence analysis and physiological and biochemical experiments would be used to identify taxonomy of cellulose-decomposing bacteria，and the cellulase activity of these strains were determined by DNS method.[Result]Fifty strains of alkali-resistant bacteria were isolated from various samples，and 12 strains of cellulolytic bacteria were screened，including 7 strains of Bacillus，2 strains of Nesterenkonia，1 strain of Brevibacterium halotolerans，1 strain of Pseudomonas，1 strain of Alishewanella，the optimum pH of most strains was 11-12，and had good salt tolerance and cellulolysis enzyme activity.Among them，Similarity of 49228 and 49239 to Nesterenkonia flava CAAS 251（T） and Pseudomonas indoloxydans IPL-1（T） was 97.71% and 98.5% respectively，they might be potential new species.[Conclusion]The research showed that alkaline bacteria are the dominant species in the treatment system of cotton pulp wastewater，those alkalophilic cellulose-decomposing bacteria can be used as engineering strains for treatment of alkaline wastewater with high concentration of cellulose.

Key words Cotton pulp wastewater;Cellulose decomposing bacteria;Screening;Identification;Alkophilic bacteria;Enzyme analysis

棉漿黑液是以棉短絨為原料生產(chǎn)棉漿粕過(guò)程中產(chǎn)生的高污染的廢水，其中含有大量的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素等有機(jī)污染物，該廢水具有堿性高、色度大、難降解的特點(diǎn)[1]，其如何深度處理已成為人們普遍關(guān)注的問(wèn)題之一。目前，對(duì)棉漿黑液的處理主要采用生物法或者以生物法為核心的耦合工藝，如生物活性炭纖維法[2]、超聲-生物法[3]和生化-物化組合工藝[4]等。在這些工藝中，微生物的種類(lèi)及代謝活性高低是決定廢水處理效率高低的關(guān)鍵因素，基于棉漿黑液具有堿性高、纖維素含量高的重要特點(diǎn)，從某些特定樣品中篩選具有分解纖維素活性的高效嗜堿細(xì)菌具有重要價(jià)值。有研究表明，棉漿黑液中蘊(yùn)含著大量嗜堿微生物，如文金麗等[5]以棉漿黑液為細(xì)菌分離培養(yǎng)基，從某化纖廠黑液生物處理系統(tǒng)中分離到16株嗜堿細(xì)菌，經(jīng)鑒定這些菌株主要為產(chǎn)芽孢的革蘭氏陰性細(xì)菌。

嗜堿細(xì)菌是一類(lèi)存在于鹽堿土壤或水體等環(huán)境中，在高pH或高鹽條件下能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)的一類(lèi)微生物[6-7]。由于長(zhǎng)期的環(huán)境選擇壓力使嗜堿細(xì)菌演化形成了特殊的生物結(jié)構(gòu)、生理機(jī)能和遺傳基因，從而對(duì)鹽堿環(huán)境的脅迫表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，此外，還可以產(chǎn)生多種堿性酶和其他生物活性物質(zhì)，是研究生物進(jìn)化、生命起源和生物多樣性的重要材料，也是一類(lèi)極具應(yīng)用前景的極端環(huán)境微生物資源[8-9]，可廣泛應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)[10]、紡織[11]、造紙[12]、污水處理[13]等領(lǐng)域。因此該研究從棉漿黑液生物處理系統(tǒng)的水樣和泥樣中分離嗜堿細(xì)菌，然后篩選具有代謝纖維素能力的活性菌株，并進(jìn)行菌種初步鑒定及酶活性測(cè)定分析，以期為嗜堿纖維素分解細(xì)菌的挖掘以及在堿性難降解廢水處理中的應(yīng)用提供菌株資源和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。采集新疆阿拉爾市某棉漿廠的棉漿黑液、生化池水樣和生化池泥樣。這3類(lèi)樣品的特點(diǎn)是色度高，含有的主要污染物為纖維素、木質(zhì)素及其水解產(chǎn)物，其中棉漿黑液的堿性最高（pH約為12.0）、纖維素含量最大，生化池水樣和泥樣的酸堿性接近中性（pH約為6.5）、纖維素較低。樣品采集過(guò)程均嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行。

1.1.2 嗜堿細(xì)菌分離培養(yǎng)基。下列培養(yǎng)基為系列pH不同的培養(yǎng)基。①改良培養(yǎng)基一號(hào)：棉漿黑液+15%瓊脂，pH 12～13，121 ℃滅菌30 min。②改良培養(yǎng)基二號(hào)：生化池水樣+15%瓊脂，pH 12～13，121 ℃滅菌30 min。③馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g（切塊于1 L水中煮沸15 min，過(guò)濾的萃取液），蔗糖20.0 g，瓊脂15.0 g，定容于1 L容器中，pH 7～13，121 ℃滅菌30 min。④LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂粉18.0 g，pH 7～13，121 ℃滅菌30 min。⑤LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7～13，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 纖維素分解細(xì)菌篩選培養(yǎng)基。羧甲基纖維素10.0 g，MgSO4 1.0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.3 g，NaCl 0.5 g，酵母粉2.0 g，瓊脂 15.0 g，定容于1 L容器中，pH 7～13，121 ℃滅菌30 min。

1.1.4 生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基。酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，瓊脂粉18.0 g，定容于1 L容器中，根據(jù)培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)不同pH和NaCl濃度，121 ℃滅菌30 min。

1.1.5 主要儀器與設(shè)備。LXJ264201型離心機(jī)（北京醫(yī)療儀器修理廠）;LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;MycyclerTM Thermod Cycler PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;HYA恒溫?fù)u床（中國(guó)科學(xué)院武漢儀器廠）;SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）;LGJ-10C型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）。

1.1.6 主要試劑。DNS試劑，采用文獻(xiàn)[14]中方法進(jìn)行配制。CMC緩沖液：稱取1.0 g CNC-Na溶于pH=9的緩沖液中（100 mL），沸水浴加熱至溶化，冷卻，過(guò)濾，取濾液50 mL，加pH=7緩沖液10 mL，混勻。剛果紅染液：精確稱取2.5 g剛果紅溶于100 mL燒杯中，定容在250 mL容量瓶。

1.2 方法

1.2.1 嗜堿細(xì)菌的篩選分離、純化及保藏。稱取不同的土樣10 g，分別放入盛90 mL帶有玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中，在搖床上振蕩約3 h。將土壤懸浮液和水樣進(jìn)行梯度稀釋，選10-2、10-3和10-4稀釋度樣品涂布于上述分離培養(yǎng)基平皿，每個(gè)平皿接種100 μL，分離培養(yǎng)基pH分別為7、8、9、10、11、12，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)皿于28 °C倒置培養(yǎng)2～5 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取單菌落至LB固體培養(yǎng)基上純化。對(duì)純化的細(xì)菌進(jìn)行編號(hào)并于30%甘油中-20 °C保藏。

1.2.2 菌株16S rRNA基因測(cè)序和序列分析。采用CTAB（cetyltrimethylammonium ammonium bromide）法提取細(xì)菌總DNA，16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物均為通用保守引物27F和1492R，測(cè)序工作由上海生物工程有限責(zé)任公司完成。將分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定菌株分類(lèi)地位。

1.2.3 產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選。將供試菌株用點(diǎn)接法接種于加1%羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)7～10 d，用1%的剛果紅染色10 min，菌落周?chē)型该魅Φ臑殛?yáng)性，即為可以產(chǎn)生纖維素酶的菌株[15]。

1.2.4 菌株生理生化及形態(tài)學(xué)觀察鑒定。

（1）活化菌株。利用三線法將12株細(xì)菌接種在LB固體培養(yǎng)基內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)2～3 d。

（2）菌株對(duì)鹽濃度的耐受性。制作鹽濃度為0、5%、10%、15%、20%、25%的LB液體培養(yǎng)基，分別將12株細(xì)菌接種于培養(yǎng)基內(nèi)，48 h后觀察測(cè)定吸光度。

（3）菌株對(duì)pH的耐受性。制備緩沖溶液pH為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的LB液體培養(yǎng)基，將12株菌接種在培養(yǎng)基內(nèi)，48 h后觀察測(cè)定吸光度。

（4）菌株對(duì)溫度的耐受性。將12株菌接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，放入溫度為10、15、20、25、30、37、40、50 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行溫度試驗(yàn)，48 h后觀察測(cè)定吸光度。

（5）菌株形態(tài)學(xué)觀察。將12株于37 ℃下培養(yǎng)48 h后的菌株置于顯微鏡下，進(jìn)行形態(tài)觀察并拍照。

1.2.5 纖維素分解細(xì)菌CMC酶活的測(cè)定。

1.2.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取11支10 mL的比色管，0～10號(hào)試管分別加入0～1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL），搖勻后加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫再用蒸餾水定容至10 mL，搖勻后在波長(zhǎng)為520 nm下測(cè)定吸光度（以1號(hào)比色管中的空白樣為對(duì)照）。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 酶活測(cè)定方法。將纖維素分解菌接種于50 mL培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床培養(yǎng)48 h，在4 ℃、10 000 r/min離心20 min 除去菌體，取上清液作為粗酶液。具體測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜堿細(xì)菌的分離 對(duì)棉漿黑液、生化池泥樣、生化池水樣3種樣品中的菌落進(jìn)行分離、純化后，共得到50株嗜堿細(xì)菌，詳細(xì)情況見(jiàn)表1。由表1可知，棉漿黑液中共分離到31株嗜堿細(xì)菌，占總數(shù)的62%;生化池水樣中共分離得到13株嗜堿細(xì)菌，占總數(shù)的26%;生化池泥樣中分離得到6株嗜堿細(xì)菌，占總數(shù)的12%。由此可見(jiàn)，棉漿黑液生物處理系統(tǒng)中含有豐富多樣的嗜堿細(xì)菌，是嗜堿細(xì)菌分離的優(yōu)良場(chǎng)所，這些嗜堿細(xì)菌可作為堿性廢水生物處理法的菌種。

上述所分離得到的嗜堿細(xì)菌大部分來(lái)自棉漿黑液中，這可能是由于細(xì)菌長(zhǎng)期適應(yīng)強(qiáng)堿性棉漿黑液的結(jié)果。而生化池水樣和泥樣中盡管微生物種類(lèi)豐富，但這2種環(huán)境均為弱酸性或堿性，故嗜堿細(xì)菌較少。

2.2 纖維素分解細(xì)菌的篩選

2.2.1 纖維素分解細(xì)菌的初篩。利用羧甲基纖維素鈉的培養(yǎng)基，對(duì)所得到的50株菌株進(jìn)行纖維素分解能力的初步篩選，詳細(xì)結(jié)果如表2所示。由表2可知，50株細(xì)菌中共篩選出12株具有分解纖維素能力的細(xì)菌，分別是49011、49082、49208、49209、49210、49228、49232、49239、49243、49252、49261、49267，占菌株總數(shù)的24%。由此可見(jiàn)，棉漿黑液生物處理系統(tǒng)中含有豐富的嗜堿纖維素分解細(xì)菌。

2.2.2 纖維素分解細(xì)菌的復(fù)篩。利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，對(duì)初步篩選的12株具有分解纖維素能力的細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)篩，測(cè)定其分解纖維素能力的強(qiáng)弱。以得到的透明圈直徑作為參考條件，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3，部分纖維素分解能力如圖1所示。

由表3可知，纖維素分解細(xì)菌的復(fù)篩結(jié)果與初篩結(jié)果是一致的，上述12株細(xì)菌均具有良好的分解纖維素能力，其中有10株細(xì)菌的透明圈直徑超過(guò)了20 mm，占總數(shù)的83%。其中7株來(lái)源于棉漿黑液中，進(jìn)一步說(shuō)明棉漿黑液是分離嗜堿纖維素分解細(xì)菌的優(yōu)良場(chǎng)所。

2.2.3 供試菌株測(cè)序。將12株具有分解纖維素能力的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果。將菌株測(cè)序結(jié)果與BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)已知種進(jìn)行比對(duì)后結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果顯示其中有7株芽孢桿菌（Bacillus），包括6株耐鹽芽孢桿菌（Bacillus halodurans）和1株沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis），共占檢測(cè)細(xì)菌的58%;2株涅斯捷連科氏菌（Nesterenkonia），占檢測(cè)細(xì)菌的17%;1株耐鹽短桿菌（Brevibacterium halotolerans）;1株假單胞菌（Pseudomonas）;1株另類(lèi)希滅氏菌（Alishewanella）。其中菌株49228和49239與已知菌的相似性較低，分別為97.71%和98.50%，為潛在新物種。從棉漿黑液中分離的菌株多以革蘭氏陽(yáng)性桿菌為主，占總數(shù)的48%。

2.3 生理生化試驗(yàn)

2.3.1 菌株對(duì)pH的耐受性。Horikoshi[16]根據(jù)耐受堿的程度不同，將在pH 10～12最適或生長(zhǎng)良好，但在pH 6.5左右不能或僅能緩慢生長(zhǎng)的稱為嗜堿細(xì)菌。在pH≥10.0最適生長(zhǎng)，且pH低于8.0時(shí)不生長(zhǎng)的為專性嗜堿細(xì)菌;在pH≥10.0最適生長(zhǎng)，且在中性環(huán)境中也能生長(zhǎng)的為兼性嗜堿細(xì)菌;能在pH 7～9生長(zhǎng)，但在pH≥10.0不能生長(zhǎng)為耐堿細(xì)菌。

對(duì)12株纖維素分解細(xì)菌的pH耐受性試驗(yàn)結(jié)果（表5）顯示，所有菌株都只能在堿性條件下生長(zhǎng)，故均為嗜堿細(xì)菌，其中49228、49232、49243、49239、49252、49261為專性嗜堿細(xì)菌，49011、49082、49208、49210、49267為兼性嗜堿細(xì)菌，無(wú)耐堿細(xì)菌?？梢?jiàn)上述所有菌株對(duì)堿性環(huán)境均表現(xiàn)出較強(qiáng)的偏嗜性和適應(yīng)性，其中大部分菌株的最適pH在10～12，這些菌株具有耐極端堿的特性。

2.3.2 菌株對(duì)溫度的耐受性。從表6可以看出，所有菌株都可以在15～37 ℃的環(huán)境中生長(zhǎng)，都不能在40 ℃以上的環(huán)境中生長(zhǎng)?？梢?jiàn)菌株對(duì)環(huán)境的依賴性不是很高，在常溫下均能夠正常生長(zhǎng)?？赡苡捎谠摼觊L(zhǎng)期在自然溫度中受到馴化，所以室外溫度中都能正常生長(zhǎng)繁殖。

2.3.3 菌株對(duì)鹽濃度的耐受性。對(duì)12株菌進(jìn)行鹽濃度耐受試驗(yàn)，結(jié)果顯示（表7），供試菌株均可在0～10%鹽濃度條件下正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出對(duì)氯化鈉的良好耐受性，而49208、49209、49210、49228對(duì)鹽濃度耐受能力更強(qiáng)，可達(dá)到20%，按照嗜鹽細(xì)菌分類(lèi)劃分，其中49208、49209、49210、49228、49243、49261為中等嗜鹽細(xì)菌?？梢?jiàn)這些菌株不僅表現(xiàn)出良好的耐堿性同時(shí)還表現(xiàn)出良好的耐鹽性，可用于鹽堿度均高的環(huán)境領(lǐng)域。

2.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 從圖2可以看出，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.7x（R2=0.999），可見(jiàn)葡萄糖濃度在0～1.0 mg/mL與吸光度線性相關(guān)性很好。2.5 纖維素酶學(xué)特性分析 從菌株纖維素酶活測(cè)定結(jié)果（表8）可以看出，總體來(lái)講，上述12株菌均具有較高的纖維素酶活力，具有較強(qiáng)的分解纖維素能力，其中49011、49082、49239、49208、49243這5株菌的酶活均在30 U以上，具有重要的應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。

3 結(jié)論與討論

該研究從棉漿黑液的各個(gè)生物處理工段的水樣和泥樣

中共分離獲得了50種嗜堿細(xì)菌，從形態(tài)等特征結(jié)構(gòu)分析，這些菌株具有良好的物種多樣性。其中12株具有明顯的纖維素分解能力，占總細(xì)菌數(shù)的24%，說(shuō)明棉漿黑液是分離嗜堿纖維素分解細(xì)菌的良好場(chǎng)所。對(duì)12株纖維素分解細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)和16S rRNA鑒定結(jié)果顯示，這些菌以芽孢桿菌為主，同時(shí)具有良好的耐鹽特性，其中有2株菌與已知菌相似度較低，為潛在新物種，具有一定后續(xù)研究?jī)r(jià)值。12株細(xì)菌的纖維素酶活結(jié)果顯示，這些菌株都可以產(chǎn)生纖維素分解酶，絕大部分都具有較高的酶活力，可見(jiàn)這些菌株可以很好地利用纖維素。該研究結(jié)果初步明確了棉漿廢水生物處理系統(tǒng)中嗜堿細(xì)菌的組成和分布，這些菌株的獲得可為鹽堿度較高、纖維素含量較高的難處理廢水的深度處理提供菌種資源，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]

許白羽，何麗，馬江平，等.棉漿粕黑液廢水處理試驗(yàn)研究與工藝優(yōu)化[J].工業(yè)水處理，2014，34（5）：60-63.

[2] 張?jiān)戒h，呂玲玲，駱俊樂(lè)，等.生物活性炭纖維（BACF）法處理棉漿黑液的研究[J].現(xiàn)代化工，2016，36（4）：141-143.

[3] 趙麗紅，孫洪軍，高艷嬌，等.超聲-生物法聯(lián)合處理棉漿黑液的研究[J].工業(yè)安全與環(huán)保，2011，37（4）：1-2.

[4] 楊健，王士芬.生化-物化組合工藝處理棉漿粕生產(chǎn)綜合廢水[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，1999（3）：31-33，43.

[5] 文金麗，繆禮鴻，王璐，等.棉漿黑液生物處理系統(tǒng)中嗜堿細(xì)菌的多樣性[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2007，53（4）：491-496.

[6] 曹軍衛(wèi)，沈萍，李朝陽(yáng).嗜極微生物[M].武漢：武漢大學(xué)出版社，2004.

[7] TAKAMI H，INOUE A，F(xiàn)UJI F，et al.Microbial flora in the deepest sea mud of the Mariana Trench[J].FEMS Microbiol Lett，1997，152（2）：279-285.

[8] XU Y，ZHOU P J，TIAN X Y.Characterization of two novel haloalkaliphilic archaea Natronorubrum bangense gen.nov.，sp.nov.and Natronorubrum tibetense gen.nov.，sp.nov.[J].Int J Syst Bacteriol，1999，49（1）：261-266.

[9] 張偉周，毛文揚(yáng)，薛燕芬，等.內(nèi)蒙古海拉爾地區(qū)堿湖嗜堿細(xì)菌的多樣性[J].生物多樣性，2001，9（1）：44-50.

[10] SAKIYAMA T，TOYOMASU T，NAGATA A，et al.Performance of protease as a cleaning agent for stainless steel surfaces fouled with protein[J].J Ferment Bioeng，1998，85（3）：297-301.

[11] DORADO J，F(xiàn)IELD J A，ALMENDROS G，et al.Nitrogen-removal with protease as a method to improve the selective delignification of hemp stemwood by the? white-rot fungus Bjerkandera sp.strain BOS55[J].Appl Microbiol Biotechnol，2001，57（1/2）：205-211.

[12] REID I，RICARD M.Pectinase in papermaking：Solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide[J].Enzyme Microb Technol，2000，26（2/3/4）：115-123.

[13] GUPTA R，BEG Q K，LORENZ P.Bacterial alkaline proteases：Molecular approaches and industrial applications[J].Appl Microbiol Biotechnol，2002，59（1）：15-32.

[14] 韓碩，趙巖，宋天順，等.纖維素分解菌的篩選和酶學(xué)性質(zhì)分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（4）：172-177.

[15] 燕紅，鐘方，高新亮，等.耐鹽堿菌株的分離篩選及生物學(xué)特性和鹽堿去除效率的研究[J].生態(tài)學(xué)雜志，2012，31（4）：1000-1008.

[16] HORIKOSHI K.Alkaliphiles：Some applications of their products for biotechnology[J].Microbiol Mol Biol Rev，1999，63（4）：735-750.