基于新型鐵基MOFs負載青蒿素的納米載藥體系構(gòu)建及抗腫瘤活性研究

李文清，畢軍霞，唐詩雨，李亞巍

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

青蒿素是從天然植物黃花蒿中提取分離得到的一種倍半萜內(nèi)酯類化合物[1]，具有非常廣泛的藥理活性，除了抗瘧之外，在抗腫瘤方面也具有非常獨特的優(yōu)勢，已成為國內(nèi)外的研究熱點[2-3]。然而，這類藥物在臨床應(yīng)用中仍存在很多問題，如水溶性差、生物利用度低、非特異性細胞毒性、半衰期短等[4-5]。因此，通過合理設(shè)計，構(gòu)建一種基于新型納米載體高效遞送青蒿素的納米載藥體系，利用其簡單、穩(wěn)定、可控等特點有效解決青蒿素應(yīng)用過程中存在的問題，實現(xiàn)減毒增效，對于其臨床應(yīng)用具有重要意義。

金屬有機框架材料(metal-organic frameworks，MOFs)是一種近些年備受關(guān)注的新興多孔雜化材料，由金屬離子與有機配體連接而成。同傳統(tǒng)的納米材料比較，該材料具有配位結(jié)構(gòu)新穎、拓撲結(jié)構(gòu)多變、孔徑可調(diào)、比表面積大等許多優(yōu)良特性，目前已被多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如催化、傳感、氣體吸附、藥物遞送等[6-7]。MIL-100(Fe)(materials of institute lavoisier-100)是由Fe3+與有機配體組裝而成的一種具有正四面體結(jié)構(gòu)的新型MOFs材料，這種材料具備良好的生物相容性、穩(wěn)定性以及靈敏的pH響應(yīng)性，可以實現(xiàn)新型納米遞藥體系對于載藥量、穩(wěn)定性及可控藥物釋放等多方面的要求[8-10]。

因此，本研究選擇MIL-100(Fe)作為青蒿素的載體材料，制備青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒，不僅能夠有效降低藥物自身的非特異性毒副作用，減少對機體正常組織的影響，同時在進入體內(nèi)后還能夠利用其高通透性和滯留效應(yīng)被動靶向至腫瘤部位，增加藥物在靶點部位的蓄積，并發(fā)揮MIL-100(Fe)材料pH敏感的特性，在腫瘤組織弱酸性的細胞環(huán)境中發(fā)生崩解，有效釋放負載藥物青蒿素，真正實現(xiàn)藥物在靶點部位的高效、精準、可控釋放。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、均苯三甲酸(BTC)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，青蒿素(美國Sigma公司)，硝酸(HNO3)、氟化鉀(KF)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，BCA(bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)；透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)，粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)，Muse全能細胞分析儀(默克密理博公司)，Imark全自動酶標儀(美國BIO-RAD公司)，CKX41-A32PH倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

人肝癌細胞HepG2(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，由吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院實驗室保存)。HepG2細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清(100 U/mL青霉素和100 μg鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度達到80%左右時，0.25%胰酶消化傳代。

1.2 MIL-100(Fe)的合成

將FeCl3·6H2O(3 mmol)、BTC(2 mmol)、HNO3(3 mmol)和KF(3 mmol)一同溶于20 mL水中，攪拌均勻，轉(zhuǎn)移至高壓釜中，加熱反應(yīng)(120 ℃)24 h，反應(yīng)結(jié)束后分別用蒸餾水及乙醇清洗，以除去未反應(yīng)的試劑，得黃色MIL-100(Fe)。

1.3 青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒的合成

稱取5.0 mg MIL-100(Fe)樣品，加入到一定量的青蒿素無水乙醇溶液中，二者質(zhì)量比為5∶1，室溫下攪拌反應(yīng)3 d，離心干燥后得到青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒。收集上清液用于測定藥物的負載量。通過與NaOH(0.2%)在50 ℃下孵育30 min，可以將青蒿素轉(zhuǎn)化為紫外吸收化合物，并檢測290 nm處的特征紫外吸收光譜。計算載藥量。

1.4 青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒對細胞增殖活性的影響

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞濃度至1×104個/mL接種96孔板中，每孔200 μL。待細胞貼壁后，給藥組分別給予不同濃度的青蒿素及青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒，每組設(shè)5復(fù)孔，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄掉孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩搖勻，在酶標儀上以波長490 nm測各孔的吸光度A490。計算細胞增殖抑制率。

1.5 青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒對細胞凋亡影響

收集青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒作用48 h后的HepG2細胞，PBS清洗2次，加入100 μL MuseTM Annexin V&Dead Cell，避光染色20 min，Muse全能細胞分析儀分析細胞凋亡變化。

2 結(jié) 果

2.1 青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒表征結(jié)果

透射電鏡結(jié)果(圖1)顯示，青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒形貌規(guī)則，分散性好，粒徑比較均勻，單分散納米粒粒徑尺寸約為100 nm；納米粒的粒徑及粒徑分布由粒度儀通過測定動態(tài)光散射得到，結(jié)果(圖2)顯示，本研究所得納米粒的平均粒徑尺寸為107.9 nm，粒徑分布范圍為60～160 nm，呈正態(tài)分布，與透射電鏡測定結(jié)果基本一致。證明本實驗已成功制得納米尺寸、形貌均一的青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒。

圖 1.青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒的透射電鏡圖片 圖 2.青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒的粒徑分布

2.2 青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒對HepG2細胞增殖的抑制作用

MTT結(jié)果(圖3)顯示，單獨的青蒿素和裝載等量青蒿素的青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒對于腫瘤HepG2細胞的增殖均具有明顯的抑制效果，而且隨著兩種藥物給藥濃度的提高，HepG2細胞的存活率均呈現(xiàn)出下降的趨勢，說明這兩種藥物對于腫瘤細胞增殖的抑制作用具有一定的劑量依賴性。另外在同樣的青蒿素濃度下，青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒對腫瘤細胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于單獨的青蒿素，這表明將青蒿素載入MOFs框架結(jié)構(gòu)內(nèi)制成納米藥物可以有效增強青蒿素小分子藥物的體外抗腫瘤效果。這種增強的細胞毒性主要是由腫瘤細胞對于納米粒子的有效內(nèi)吞所引起的。

圖 3 不同濃度的青蒿素和青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒對HepG2細胞增殖的抑制作用

2.3 青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒對HepG2細胞凋亡的影響

利用流式細胞儀采用Annexin V-FITC/PI染色法檢測了青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生凋亡的情況。結(jié)果(圖4)顯示，對照組細胞早期凋亡率為3.12%，然而經(jīng)過不同濃度的青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒處理后，腫瘤細胞的凋亡比例顯著提升，并且隨著給藥濃度的增加，細胞凋亡率也表現(xiàn)出升高趨勢。20、40和60 μmol/L的青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒給藥組的早期凋亡率分別為13.1%、25.36%和30.06%，說明青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒可以誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)凋亡行為呈劑量依賴性。

圖 4 不同濃度青蒿素@MIL-100(Fe)納米粒對HepG2細胞凋亡的影響

3 討 論

納米技術(shù)在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用為延長患者的壽命和提高其生活質(zhì)量帶來了新的希望，成為未來醫(yī)學(xué)發(fā)展最重要的指向。MIL-100(Fe)是由Fe3+與有機配體組裝而成的一種具有正四面體結(jié)構(gòu)的新型金屬-有機框架材料[11-12]，具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性以及靈敏的pH響應(yīng)性。MIL-100(Fe)在中性生理條件下結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，能夠保證對藥物的有效包封，避免因藥物提前釋放而對機體造成損傷；而在弱酸性的環(huán)境中，結(jié)構(gòu)中的配位鍵就會發(fā)生解離，材料發(fā)生分解，同時釋放出負載藥物和Fe離子。這樣既能夠?qū)崿F(xiàn)負載藥物在腫瘤部位的精準、可控釋放，同時外源性鐵離子的引入還能夠有效解決治療過程中內(nèi)源性Fe不足的問題，極大的加強青蒿素對癌細胞的殺傷作用[13]。

本研究創(chuàng)造性地利用新型MOFs材料MIL-100(Fe)作為青蒿素的載體材料，構(gòu)建納米載藥體系，成功合成MIL-100(Fe)，并載入青蒿素，得到穩(wěn)定性好、形貌規(guī)則、尺寸均一的載藥納米粒。體外抗腫瘤研究結(jié)果顯示，與游離青蒿素相比，裝載等量青蒿素的納米粒對于HepG2腫瘤細胞的增殖具有更強的抑制作用，并且能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，說明將青蒿素載入MIL-100(Fe)框架結(jié)構(gòu)內(nèi)制成納米藥物能夠有效增強其體外抗腫瘤活性。

本研究將為青蒿素類藥物的抗腫瘤應(yīng)用提供新的思路和發(fā)展方向，也將有助于青蒿素尋找到臨床上治療腫瘤的新突破口。