UFLC法同時測定芍藥甘草湯中甘草苷和甘草酸的含量

崔 悅，王佳楠，范琢玉，湯鑫淼，馮 波，關(guān) 皎，朱鶴云

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

芍藥甘草湯是由白芍、甘草配伍而成的中藥復(fù)方湯劑，其應(yīng)用歷史悠久，療效顯著，早在漢代張仲景所著《傷寒論·辨太陽病脈證并治》中便有記載。方中白芍養(yǎng)血斂陰，甘草補(bǔ)脾益氣，兩者相伍，可生緩急止痛之效。藥理研究表明，芍藥甘草湯可抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽，臨床常用于多種痛癥[1]。

中藥理論有“十方九草”之說，也就是說甘草在中藥傳統(tǒng)方劑中使用頻繁。甘草含有三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類和多糖類等成分，其中三萜皂苷類(代表藥物為甘草酸)和黃酮類(代表藥物為甘草苷)是甘草中的主要活性成分。研究表明，甘草酸具有抗病毒、抗炎、抗氧化、調(diào)免疫、促吸收等多種藥理活性[2-3]，甘草苷具有抗抑郁、保肝、神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)等作用[4-6]。目前甘草的質(zhì)量研究多采用紫外法[7]、熒光法[8]、高效液相色譜法[9-10]等方法。然而，這些方法樣品前處理復(fù)雜、專屬性和靈敏度較差、分析時間過長。超快速液相色譜(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)技術(shù)分析效率高、溶劑消耗少，廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的研究中[11-12]。本研究采用UFLC法同時測定芍藥甘草湯中甘草苷和甘草酸的含量，可為芍藥甘草湯的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(日本島津)；XK96-A快速混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；N-1300-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA東京理化器械株式會社)。

芍藥、甘草藥材(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，購自吉林大藥房)，由吉林醫(yī)藥學(xué)院李景華副教授進(jìn)行鑒定，確定為真品；對照品甘草苷(中國食品藥品檢定研究院，111610—201607，純度>98%)，甘草酸(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，151014，純度>98%)。色譜純乙腈和甲醇(美國Fisher公司)。

1.2 色譜條件

色譜柱為Shimadzu Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)；流動相為0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～4 min，5%～20%B；4～12 min，20%～40%B；12～15 min，40%～45%B)，流速為0.8 mL/min，檢測波長為237 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。甘草苷和甘草酸典型色譜圖見圖1。

1.甘草苷；2.甘草酸

1.3 對照品溶液的配制

取甘草苷和甘草酸對照品，用甲醇配制成甘草苷和甘草酸為1.0 g/L的對照品儲備液。

1.4 供試品溶液的制備

1.4.1芍藥甘草湯的制備

按照《傷寒論》所述，取藥材白芍12 g，炙甘草12 g，加10倍水煮沸1 h，過濾，殘渣再次回流1 h，將第1次與第2次回流提取的濾液合并于干凈的容器內(nèi)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸濃縮至50 mL，置于容量瓶中所得即芍藥甘草湯。

1.4.2芍藥甘草湯供試品溶液制備

精密吸取上述芍藥甘草湯0.5 mL，加入甲醇25 mL超聲30 min，上清液用0.22 μm濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.5 線性關(guān)系考察

吸取甘草苷和甘草酸對照品溶液，置于相同5 mL容量瓶中，用甲醇配制成甘草苷和甘草酸濃度均為2、5、10、20、50、100 mg/L的系列混合對照品溶液，以色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，求線性方程。

1.6 精密度試驗(yàn)

吸取混合對照品溶液，甘草苷與甘草酸濃度均為50 mg/L，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。

1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次的芍藥甘草湯樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析。

1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批芍藥甘草湯樣品共6份，并制備供試品溶液，計算兩成分的含量。

1.9 回收率試驗(yàn)

向已知含量的芍藥甘草湯樣品(甘草苷0.398 mg/L、甘草酸含量0.647 mg/L)9份(0.25 mL/份)中加入相當(dāng)于樣品中含量80%、100%、120%的對照品各3份，分析并計算回收率。

1.10 樣品含量測定

測定并計算6 批芍藥甘草湯供試品溶液中兩成分的含量。

2 結(jié) 果

2.1 線性關(guān)系考察

獲得甘草苷、甘草酸的線性回歸方程分別為：

Y=4.3614×104X-2.887×104，r=0.999 8

Y=1.058×104X-9.981×103,r=0.999 4

兩種成分在2～100 mg/L線性關(guān)系良好。

2.2 精密度試驗(yàn)

兩種成分峰面積的RSD分別為0.6%和1.0%，即儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

兩種成分峰面積的RSD分別為0.9%和2.9%，即樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

兩種成分的含量分別為0.398 mg/L(RSD為2.3%)和0.647 mg/L(RSD為1.7%)，即方法的重復(fù)性符合要求。

2.5 回收率試驗(yàn)

芍藥甘草湯中甘草苷和甘草酸的回收率分別為98.8%和99.1%(表1)。

表 1 芍藥甘草湯中甘草苷和甘草酸的回收率

兩種成分的含量見表2。

表 2 芍藥甘草湯樣品中甘草苷和甘草酸的含量(g/L)

2.6 含量測定

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)考察比較了多種水相和有機(jī)相做為流動相，包括添加不同種類酸(甲酸和磷酸)和不同濃度酸(0.1%和1%)的水、甲醇、乙腈。以基線、分離度等作為評價指標(biāo)。最終選擇乙腈-0.1%磷酸水做為流動相。

實(shí)驗(yàn)采用PDA檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行掃描，甘草苷和甘草酸分別在276 nm和248 nm處有最大吸收。綜合比較，237 nm波長下兩種成分峰響應(yīng)值較高，故選定其為檢測波長。

芍藥甘草湯是由芍藥、甘草配伍所得，兩者協(xié)同調(diào)和肝脾、柔筋止痛。研究表明，芍藥甘草湯的原方入血成分多達(dá)17種，因此對原方中化學(xué)成分的整體研究十分重要[13]。本研究選取甘草中兩種活性成分即甘草苷和甘草酸，建立了同時檢測芍藥甘草湯中這2種水溶性成分的UFLC方法，與已有方法比較更加快速、分離效果更佳[9]。通過測定得知，購自吉林大藥房的炙甘草藥材均符合藥典要求(甘草苷含量不低于0.50%，甘草酸含量不低于1.0%)。本研究從定量的角度，對經(jīng)典名方芍藥甘草湯的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了初步研究，建立了芍藥甘草湯穩(wěn)定、簡便的UFLC測定方法，可為其新劑型開發(fā)提供參考。