長江口鄰近海域藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石微量元素初步分析

瞿俊躍，方 舟，2，3，4，5，陳新軍，2，3，4，5

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，上海 201306）

藍(lán)點(diǎn)馬鮫（Scomberomorus niphonius），屬鱸形目（Perciformes）鯖科（Scombridae）馬鮫屬，廣泛分布于中國、日本和韓國近海的暖溫性水域中［1-3］。該物種為高度洄游經(jīng)濟(jì)性魚種，在近年來氣候事件頻發(fā)且中國近海漁業(yè)資源日益衰退的背景下，藍(lán)點(diǎn)馬鮫仍然是少數(shù)維持高產(chǎn)的魚類之一，近5年在我國的年產(chǎn)量保持在30～40萬t之間［4-6］。掌握魚類的生活史，有助于進(jìn)一步了解不同時(shí)期魚類的生境變化情況，進(jìn)而為漁業(yè)資源可持續(xù)利用和管理提供參考依據(jù)［7］。耳石作為探究魚類生活史過程的優(yōu)良材料之一，具有不易被破壞的外形結(jié)構(gòu)，同時(shí)含有豐富的生態(tài)信息，目前已被廣泛用于群體劃分［8-10］、年齡與生長［11-14］、生境反演［15-16］等方面的研究。同時(shí)耳石主要由碳酸鈣組成，具有代謝惰性，魚類生活環(huán)境中的相關(guān)元素會(huì)永久沉積于耳石中［17-18］。魚類耳石能吸收其所棲息的環(huán)境元素，元素一旦被沉積就很難再被機(jī)體吸收，成為記錄魚類生活史足跡的元素指紋。因此，耳石的微化學(xué)分析可以重建魚類的生活史歷程或者揭示其特定生活史階段所經(jīng)歷的水環(huán)境變化［19-23］。目前，利用該方法已經(jīng)成功地推測了我國近海小黃魚（Larimichthys polyactis）［24］、棘 頭 梅 童 魚（Collichthys lucidus）［25］、鮸（Miichthys miiuy）［26］等石首魚科魚類在不同時(shí)期的生境變化規(guī)律。作為典型的長距離洄游性種類，藍(lán)點(diǎn)馬鮫有著顯著的沿岸—外海洄游的特征［2］。已有相關(guān)的研究對(duì)黃海藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石微化學(xué)進(jìn)行了初步分析，對(duì)其生活史情況有了初步了解［15］，然而目前仍集中于關(guān)于耳石中微量元素組成，并僅簡單分析不同時(shí)期微量元素的變化情況。藍(lán)點(diǎn)馬鮫不同生活史時(shí)期所處的棲息環(huán)境和特征有較大的不同［15-16］，研究主要生活史的變化規(guī)律有著重要意義。為此，本研究選取拖網(wǎng)船在長江口鄰近海域所捕獲的藍(lán)點(diǎn)馬鮫個(gè)體，分析其耳石的微量元素組成，討論不同耳石區(qū)域微量元素的變化，結(jié)合回歸樹分析，初步劃分藍(lán)點(diǎn)馬鮫的生活史階段，推測其不同生長階段的生境變化，以期為后續(xù)合理開發(fā)、利用以及養(yǎng)護(hù)該重要漁業(yè)資源提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

本研究所用樣本是由底拖網(wǎng)漁船在長江口鄰近海域采集，捕撈作業(yè)海域見圖1。所用的網(wǎng)具為有翼單囊拖網(wǎng)，網(wǎng)具主尺度55 m×26 m，上綱長37 m、下綱長42 m、網(wǎng)目尺寸25 mm。樣本采集以非禁漁期時(shí)期每個(gè)月采一次，每次保證樣品數(shù)量在20尾左右，時(shí)間跨度為2018年9月—2019年2月。

圖1 長江口鄰近海域藍(lán)點(diǎn)馬鮫采樣站點(diǎn)Fig.1 Sampling locations of Scomberomorus niphonius in waters adjacent to the Yangtze Estuary

1.2 生物學(xué)測定與耳石提取

在實(shí)驗(yàn)室解凍后對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫進(jìn)行生物學(xué)測定，包括叉長（fork length，F(xiàn)L）、體質(zhì)量（body weight，BW）和性別，叉長精確至1 mm，體質(zhì)量精確至1 g。利用鑷子提取出藍(lán)點(diǎn)馬鮫的一對(duì)矢耳石，并存放于盛有95%乙醇溶液的帶有編號(hào)的離心管中保存。

1.3 耳石研磨與微量元素測定

對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石采取橫截面研磨，耳石切片的制作過程包括包埋、切割、研磨和拋光。先將耳石清洗干燥后放入塑料模具中，沿壁緩慢倒入由固化劑與亞克力粉調(diào)配而成的包埋劑來進(jìn)行耳石包埋，并放置到通風(fēng)陰涼處待其完全硬化；然后用120、600、1 200和2 500目的防水耐磨砂紙將耳石逐步研磨至核心，研磨過程中需不斷在顯微鏡下觀察，以免磨過核心；最后用氧化鋁水絨布拋光研磨好的切片，再將研磨好的耳石切片進(jìn)行編號(hào)保存。

本研究共計(jì)選取了研磨后的18枚耳石切片（表1），使用激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry，LA-ICP-MS）來進(jìn)行耳石打點(diǎn)與微量元素測定。耳石打點(diǎn)采用等距法的方式進(jìn)行，從核心區(qū)至邊緣區(qū)每100μm取一個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)耳石長軸平均能獲得7～9個(gè)樣點(diǎn)。微區(qū)每個(gè)取樣點(diǎn)測定所含的元素，激光剝蝕過程中采用氦氣作載氣、氬氣為補(bǔ)償氣以調(diào)節(jié)靈敏度。每個(gè)時(shí)間分辨分析數(shù)據(jù)包括大約20 s的空白信號(hào)和60 s的樣品信號(hào)。具體儀器的操作條件見表2。采用ICPMSDataCal軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行離線處理（包括對(duì)樣品和空白信號(hào)的選擇、儀器靈敏度漂移校正、元素含量計(jì)算）。

表1 長江口鄰近海域藍(lán)點(diǎn)馬鮫信息Tab.1 Information of Scomberomorus niphonius in waters adjacent to the Yangtze Estuary

表2 耳石LA-ICP-MS工作參數(shù)Tab.2 Analytical parameters of LA-ICP-MS for otolith

1.4 數(shù)據(jù)分析

1）基于ICPMSDataCal軟件處理完的數(shù)據(jù)，選擇出均值大于0.1 mol·mol-1的元素，并依據(jù)各元素濃度含量利用隨機(jī)森林法（random forest）進(jìn)行分析，選取相對(duì)重要性超過5%的元素。隨機(jī)森林是通過自助法（bootstrap）重采樣技術(shù)，從原始訓(xùn)練樣本集N中重復(fù)隨機(jī)抽取k個(gè)樣本生成新的訓(xùn)練樣本集合，然后根據(jù)自助樣本集生成k個(gè)分類樹組成隨機(jī)森林，新數(shù)據(jù)的分類結(jié)果按分類樹投票多少形成的分?jǐn)?shù)而定。其實(shí)質(zhì)是對(duì)決策樹算法的一種改進(jìn)，將多個(gè)決策樹合并在一起，每棵樹的建立依賴于一個(gè)獨(dú)立抽取的樣品，森林中的每棵樹具有相同的分布，分類誤差取決于每一棵樹的分類能力和它們之間的相關(guān)性。然后將上述重要元素通過與Ca的比值進(jìn)行呈現(xiàn)，并且分別求出它們的最大值、最小值、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2）為消除各元素絕對(duì)值的誤差，繪制各微量元素與Ca比值在時(shí)間序列上的分布模式圖，根據(jù)所打點(diǎn)的位置比較不同生長階段上微量元素沉積的差異。

3）基于相關(guān)重要性較高的微量元素（大于10%），采用多元回歸樹模型（multivariate regression tree model，MRT）來形成多個(gè)時(shí)間序列聚類，進(jìn)而劃分出藍(lán)點(diǎn)馬鮫不同的生活史階段，再結(jié)合微量元素比值在時(shí)間序列上的變化趨勢來大致推測出藍(lán)點(diǎn)馬鮫的棲息地分布及其變動(dòng)。

本文所有統(tǒng)計(jì)方法均通過R語言（3.63版本）操作完成，其中模型運(yùn)用的加載包為randomForest和mvpart［27-28］。

2 結(jié)果與分析

2.1 耳石主要微量元素分析

藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石中共檢測出元素14種（濃度大于0.1μmol·mol-1），其中濃度最高的為Ca元素，濃度為（410 858.54±665.55）μmol·mol-1（表3）。耳石各微量元素含量從高到低依次為鈣（Ca）、鈉（Na）、鍶（Sr）、鐵（Fe）、鎂（Mg）、錳（Mn）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎳（Ni）、鋰（Li）、鎘（Cd）、銅（Cu）、鈷（Co）、鉛（Pb）。

表3 藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石微量元素含量Tab.3 Trace element concentration in Scomberomorus niphonius otolith （μmol·mol-1）

2.2 元素重要性分析

基于隨機(jī)森林法對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石中14種元素含量進(jìn)行分析，選取重要性較高的微量元素（圖2）。結(jié)果表明，Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba的重要性較高且可應(yīng)用于分析生活史變動(dòng)的研究中（其相對(duì)重要性均大于5%）。其中，Mg的重要性相關(guān)度最高，說明Mg的含量變化可以較好地呈現(xiàn)藍(lán)點(diǎn)馬鮫生活史變動(dòng)特征，Na和Mn次之，說明這些元素對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫生活史影響較大；而Co、Cd、Zn、Ni、Pb、Fe和Li的相對(duì)重要性小于5%，說明這些元素對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫生活史的影響較小，因而不用于之后的聚類分析。

圖2 耳石微量元素相對(duì)重要性分析Fig.2 Relative importance analysis of trace elements in otoliths

2.3 藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石各微量元素比值

對(duì)隨機(jī)森林篩選出的7種重要微量元素Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba的含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。計(jì)算與Ca比值后發(fā)現(xiàn)，Sr和Na的含量較高，其次為Mg、Mn和Ba，Cu的含量最低（表4）。

表4 藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石微量元素與鈣的比值Tab.4 Ratio of trace elements to Ca in Scomberomorus niphonius otolith

2.4 藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石不同區(qū)域元素的組成與差異

藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石不同區(qū)域上微量元素變動(dòng)可反映其不同的生長階段上的特征。各微量元素與Ca的比值在時(shí)間序列上有著明顯的變化趨勢，且均呈現(xiàn)非均勻分布（圖3）。耳石Na∶Ca從核心區(qū)至450μm處基本不變，在450～600μm過程中逐漸上升，至600μm之后開始呈現(xiàn)快速下降的趨勢，于1 350μm處達(dá)到最低值；耳石Mg∶Ca從核心區(qū)至450μm呈現(xiàn)快速下降的趨勢，450μm～1 350μm下降速度減緩，1 350μm過后存在小幅度上升的趨勢；耳石Mn∶Ca從核心區(qū)開始至600μm呈現(xiàn)小幅上升趨勢，至600μm處之后出現(xiàn)明顯的下降趨勢；耳石Cu∶Ca從核心區(qū)至450μm呈現(xiàn)小幅上升的趨勢，450～1 350μm呈現(xiàn)階梯下降的趨勢，1 350μm之后存在小幅回升的趨勢；耳石Sr∶Ca從核心區(qū)至150μm處呈現(xiàn)顯著降低，至150～600μm處基本保持不變，600μm之后呈現(xiàn)波動(dòng)變化；耳石Ba∶Ca從核心區(qū)至150μm呈現(xiàn)上升的趨勢，150～450μm處呈現(xiàn)下降趨勢，450～750μm呈現(xiàn)小幅度回升，750～1 200μm呈現(xiàn)明顯的快速下降趨勢，1 200 μm之后小幅提升。

圖3 耳石微量元素與Ca比值在時(shí)間序列上的變化趨勢Fig.3 Change trend of the ratio of otolith trace elements to Ca in time series

2.5 多元時(shí)間序列上的聚類

根據(jù)上述分析，選擇相關(guān)重要性高的元素（＞10%），采用多元回歸模型來對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石的微量元素（即對(duì)應(yīng)不同的生長階段）進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，從耳石核心至邊緣一共存在4個(gè)分割點(diǎn)，分別為150μm、450μm、750μm和1 200μm，與此同時(shí)形成了5個(gè)聚類，每個(gè)聚類里也存在不同數(shù)量的節(jié)點(diǎn)（圖4），其中重要元素比值在不同聚類中存在一定的差異和可參考的生物學(xué)特征指標(biāo)（圖5，表5）。聚類1可代表藍(lán)點(diǎn)馬鮫生長的早期階段，Na∶Ca值和Mg∶Ca值從核心至150μm含量存在小幅下降，而Mn∶Ca值存在小幅上升；聚類2中除了Mg∶Ca外其他的微量元素比值的變化趨勢不大，Mg∶Ca存在大幅的下降；聚類3中微量元素比值的變化趨勢相較聚類2略微有所差異，Na∶Ca值呈現(xiàn)小幅增長，Mg∶Ca值呈現(xiàn)小幅下降趨勢，Mn∶Ca值呈現(xiàn)大幅下降；聚類4的生長階段持續(xù)時(shí)間較長，其中3個(gè)重要元素的比值變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢；聚類5中3個(gè)重要元素比值變化趨勢各不相同，Mg∶Ca值略有上升，Mn∶Ca值不斷下降，降至最低，Na∶Ca值在降到最低后略有上升。

圖4 藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石微量元素在時(shí)間序列上的聚類Fig.4 Cluster of Scomberomorus niphonius otolith trace elements in time series

圖5 藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石重要微量元素在對(duì)應(yīng)的不同生活史階段上的變動(dòng)Fig.5 Change of important otolith trace elements of Scomberomorus niphonius at different life history stages

表5 每個(gè)聚類對(duì)應(yīng)的重要元素的含量Tab.5 Concentration of important trace elements corresponding to each cluster

3 討論

3.1 主要微量元素變化規(guī)律

本研究對(duì)14個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微量元素進(jìn)行了重要性分析，篩選出了7個(gè)重要微量元素，分別為Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba。其中Ca元素含量最高。魚類耳石中含有30多種元素，其中的C、Ca、O構(gòu)成耳石的基質(zhì)碳酸鈣（CaCO3），其余大多為微量和痕量元素［24］。耳石中元素主要來源于魚類生活的水環(huán)境和食物，同時(shí)受發(fā)育階段和生理因素等多方面影響［26］，是一個(gè)復(fù)雜的生物地化過程（biogeochemical process）。水體元素被吸收進(jìn)入耳石的過程中，當(dāng)流經(jīng)水環(huán)境-血液、血液-血液結(jié)合蛋白、血液-淋巴液、淋巴液-耳石等4個(gè)界面時(shí)［29-30］，元素間親和力和化學(xué)行為對(duì)耳石中的元素含量起著決定性作用。Sr元素相對(duì)含量較高可能是由于Sr是Ca的同族元素，離子半徑與Ca接近，軟酸離子易進(jìn)入耳石晶格中，在碳酸鈣的沉積過程中Sr離子置換Ca離子進(jìn)入耳石晶格［31］。Cu元素相對(duì)重要是由于軟酸離子與血漿蛋白結(jié)合會(huì)形成穩(wěn)定的有機(jī)化合物，其中70%～100% 的Cu結(jié)合在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上［32］，盡管這些蛋白結(jié)合物容易排出體外，但由于其較高的含量和穩(wěn)定性，一定程度上能促使軟酸離子進(jìn)入耳石的晶體結(jié)構(gòu)［32-33］。本研究中重要微量元素與PAN等［15］對(duì)黃海海域藍(lán)點(diǎn)馬鮫微量元素的研究有所不同。重要微量元素存在差異與東海和黃海的海洋環(huán)境存在關(guān)聯(lián)，長江沖淡水帶來了大量的陸源污染，因而可能是導(dǎo)致重金屬元素Mn和Cu含量偏高的潛在原因［34］。

3.2 不同生長階段耳石微量元素與生活史特征

藍(lán)點(diǎn)馬鮫具洄游性，會(huì)在產(chǎn)卵場、索餌場和越冬場之間做長距離的季節(jié)性洄游。耳石中微量元素對(duì)生境“履歷”、洄游模式等研究具有針對(duì)性和客觀性，即使僅有少量標(biāo)本依舊可以反演魚類自然棲息生境的動(dòng)態(tài)變化過程［35-37］。本研究對(duì)不同生長階段耳石微量元素進(jìn)行了分析。在大多數(shù)洄游魚類耳石中Sr∶Ca值可以反映其生活史處于淡水、半咸水和海水時(shí)期的生長環(huán)境［38］，從而較為準(zhǔn)確而直觀地“回溯”生活史“履歷”，“重建”其自然棲息環(huán)境，且Sr元素表征海域及個(gè)體棲息環(huán)境的鹽度和溫度變化，也是個(gè)體新陳代謝的重要營養(yǎng)元素［39-40］，但在長江口鄰近海域藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石微量元素中，Sr∶Ca相對(duì)沒有規(guī)律且含量顯著低于同海域的小黃魚、棘頭梅童魚、鮸和銀鯧（Pampus argentus）［24-26］，這可能是由環(huán)境溫度或者某些特殊生理作用影響所導(dǎo)致，因而藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石Sr∶Ca不適合作為其生境履歷的指標(biāo)。

本研究表明，Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca元素含量在不同生活史階段存在一定的區(qū)別，可以作為生境履歷的指標(biāo)，并基于這3種微量元素對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫生活史進(jìn)行了回歸樹聚類，結(jié)果表明，藍(lán)點(diǎn)馬鮫可能存在5個(gè)生活史階段。已有研究表明，溫度對(duì)耳石Mg元素值具有一定的影響，因而Mg在各生活史階段間存在顯著性差異，可以代表?xiàng)h(huán)境的變動(dòng)，孵化期耳石中的Mg∶Ca顯著高于其他階段，可能是由于Mg含量與耳石原基碳酸鈣晶體存在形式有關(guān)［41］，且藍(lán)點(diǎn)馬鮫產(chǎn)卵場大多聚集在中國沿岸海域，產(chǎn)卵月份為4—6月，海表溫度相對(duì)較高，但9月—次年2月藍(lán)點(diǎn)馬鮫開始索餌洄游和越冬洄游，向離岸的深層海域洄游，棲息環(huán)境海溫較低；在產(chǎn)卵階段，Mg∶Ca比值有一個(gè)小幅度的回升，可能是由于3—5月藍(lán)點(diǎn)馬鮫開始產(chǎn)卵洄游，重新向海溫偏高的近岸淺層水洄游導(dǎo)致的。而Mn元素指示著陸源污染物的含量以及對(duì)個(gè)體生長發(fā)育的影響，生長階段初期，東海的長江口是藍(lán)點(diǎn)馬鮫重要的產(chǎn)卵場之一，Mn∶Ca較高可能與長江口陸源污染較高存在關(guān)聯(lián)［42］。

綜上所述，Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca比值存在差異，這與自身生理機(jī)制的調(diào)控和生活史不同階段海域的水環(huán)境變化有關(guān)，并且Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca可作為構(gòu)建藍(lán)點(diǎn)馬鮫生境履歷的潛在標(biāo)志。今后的研究中，應(yīng)該更多考慮將不同時(shí)期的環(huán)境因子與微量元素相結(jié)合，從海洋環(huán)境變化的角度更準(zhǔn)確地判斷藍(lán)點(diǎn)馬鮫的生活史變化。