一種山梨酸鉀快速檢測(cè)試劑盒的研究

張 岐，安斌芳，王立霞，鄭雨桐，王 佳，郭曉晴

（吉林省北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林吉林 132013）

山梨酸鉀，又名2,4-己二烯酸鉀，是山梨酸的鉀鹽，分子式為C6H7O2K，白色至淺黃色鱗片狀結(jié)晶、晶體顆粒或晶體粉末，無臭或微有臭味，長(zhǎng)期暴露在空氣中易吸潮、被氧化分解而變色，易溶于水，溶于丙二醇和乙醇[1-2]。其常被用作防腐劑，通過與微生物酶系統(tǒng)的巰基結(jié)合從而破壞許多酶系統(tǒng)，毒性遠(yuǎn)低于其他防腐劑。山梨酸鉀含量一旦超標(biāo)且長(zhǎng)期被人們食用，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生傷害，在一定程度上抑制骨骼生長(zhǎng)，以及損傷肝和腎[3]。因此，在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)等方面，山梨酸鉀含量的檢測(cè)具有極其重要的意義[4]。本文研制了乳酸菌中山梨酸鉀的檢測(cè)試劑盒，并研究了其制作工藝、最低檢測(cè)限、保存條件及時(shí)間等，該試劑盒具有快速檢測(cè)、反應(yīng)靈敏、攜帶方便及成本低廉等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸鉀、2-硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric Acid，TBA）、氫氧化鈉（粒狀）、鹽酸、硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純；30%雙氧水；普通慢速定性濾紙、乙酸纖維素膜（Q/HSG 1-93）、硝酸纖維素膜（Startorius CN140）；PVC膠板（DB-8）、聚酯纖維素膜（MA0800）、玻璃纖維素膜（GL-b 01）、吸水墊（GRADE 270）、塑料卡（A-8）和銜接膠帶：市售。“暢益星”乳酸菌風(fēng)味飲料：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS-50X65-B-Ⅱ）；電子天平（沈陽(yáng)龍騰有限公司）；往復(fù)式水浴恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）；3個(gè)250 mL燒杯；一個(gè)50 mL容量瓶；一個(gè)100 mL容量瓶；膠頭滴管；玻璃棒；250 mL量筒；50 mL容量瓶；多個(gè)試管；3個(gè)空平板（15 cm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

利用山梨酸鉀與雙氧水-硫酸溶液氧化后形成丙二醛，然后丙二醛與硫代巴比妥酸（TBA）生成紅色化合物三川甲，通過顯色的深淺與山梨酸鉀的含量在一定范圍內(nèi)成正比為理論基礎(chǔ)，化學(xué)反應(yīng)式 如下：

1.3.2 山梨酸鉀溶液的配制

稱取干燥的山梨酸鉀粉末0.250 g，加入蒸餾水50 mL，用50 mL容量瓶定容，配制出5.0 g/L的山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液。然后將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成6個(gè)等級(jí)的濃度梯度，配制成山梨酸鉀應(yīng)用液，濃度分別為5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L的山梨酸鉀水溶液。

1.3.3 乳酸菌中山梨酸鉀濃度梯度的配制

稱取干燥的山梨酸鉀粉末0.125 g、0.250 g、 0.375 g、0.500 g和0.625 g分別加入6個(gè)5 mL乳酸菌飲料中，制備濃度分別為6.0 g/L、5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L和1.0 g/L的溶液。

1.3.4 顯色劑濃度的確定

稱取干燥的硫代巴比妥酸粉末4.00 g，用250 mL 容量瓶定容，配制出16.0 g/L的硫代巴比妥酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后用標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成4.0 g/L、8.0 g/L的硫代巴比妥酸溶液。不同濃度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、 1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸鉀溶液氧化之后分別加入4.0 g/L、8.0 g/L、16.0 g/L的硫代巴比妥酸溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，確定顯色反應(yīng)的最佳顯色劑濃度。

1.3.5 試紙條的制備及紙型篩選

選擇普通慢速定性濾紙、乙酸纖維素膜、硝酸纖維素膜，將其裁剪成邊長(zhǎng)為8 cm正方形，用16.0 g/L 硫代巴比妥酸中浸泡5～10 min，立即用鑷子取出置于恒溫箱（37 ℃）中干燥30 min，干燥結(jié)束后，觀察經(jīng)過硫代巴比妥酸浸泡的試紙條是否有變形和變色現(xiàn)象。若試紙條無變形和變色現(xiàn)象，將試紙的四邊統(tǒng)一裁剪成3 cm×0.5 cm規(guī)格的長(zhǎng)條，儲(chǔ)存于避光、干燥、密閉處，備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將試紙條整齊地放置于平板上。然后滴加經(jīng)1% H2O2氧化后的不同濃度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和 0.2 g/L）的山梨酸鉀溶液。觀察試紙的顯色情況，從顯色速度、顯色效果判斷顯色是否穩(wěn)定。

1.3.6 靈敏度檢測(cè)

用16 g/L的硫代巴比妥酸浸泡試紙條，然后分別與氧化之后的不同濃度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸鉀溶液進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)，得出最低的顯色濃度。

1.3.7 試紙條的保質(zhì)期

將部分試紙條裝入用黑色塑料袋密封的試管中，用橡膠塞塞緊放入冰箱（4 ℃），即模擬低溫、避光、隔氧的保存環(huán)境。部分不進(jìn)行任何處理，放置于抽屜中，即室溫、普通避光、干燥環(huán)境。每隔2 d取出幾片進(jìn)行檢測(cè)限和中等山梨酸鉀濃度的顯色實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在上午或下午固定時(shí)間進(jìn)行，盡量在相同光照強(qiáng)度下記錄和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色劑濃度的確定

隨著山梨酸鉀和TBA溶液濃度的增加，顯色逐步加深。用16.0 g/L TBA溶液制作的試紙顯色效果最好，具體見圖1和表1。

表1 不同TBA濃度時(shí)水的顯色結(jié)果

圖1 不同濃度山梨酸鉀溶液 在不同濃度TBA溶液試紙的顯色結(jié)果

2.2 試紙條的制備及篩選

試紙條是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素，其選擇需要滿足易吸附試劑且吸附量較大、干燥時(shí)間短、顯色速度快和顏色變化明顯等要求。本實(shí)驗(yàn)分別選用3種常見類型的試紙條，觀察顯色效果，確定最佳試紙條。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種試紙條，普通定性濾紙吸藥量少，顯色效果差；乙酸纖維素膜雖吸藥量較多，但顯色結(jié)果一般。只有硝酸纖維素膜的吸藥量大，吸藥均勻，浸藥干燥后形狀沒有變化，手感也無明顯的改變，可確定為最佳紙型。顯色結(jié)果表明，該類型試紙條顯色均勻，顯色速度快且顏色持續(xù)時(shí)間久，顯色后紙的變形程度小，適合做成產(chǎn)品（表2）。因此，選擇硝酸纖維素膜在乳酸菌中進(jìn)行顯色 實(shí)驗(yàn)。

表2 試紙條的吸藥量、顯色效果的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

隨著山梨酸鉀濃度的增加，顯色逐步加深。用16.0 g/L TBA溶液制作的試紙顯色效果最好，本試紙條的檢測(cè)范圍大于1.0 g/L，最低檢出限是1.0 g/L （圖1）。

用試紙法分別檢測(cè)乳酸菌中不同濃度梯度的山梨酸鉀溶液，結(jié)果表明，當(dāng)山梨酸鉀溶液的濃度低于1.0 g/L時(shí)，肉眼無法辨別試紙的顏色變化。隨著山梨酸鉀濃度增加，試紙顯色加深，當(dāng)山梨酸鉀溶液濃度達(dá)到3.0 g/L時(shí)，試紙顯色為深棕色。因此，試紙的最低限度1.0 g/L（圖2），此濃度等于乳酸菌中出現(xiàn)的山梨酸鉀濃度（1.0 g/L）[5]。

圖2 乳酸菌中不同濃度山梨酸鉀顯色結(jié)果

2.4 試紙條的保質(zhì)期

由表3可知，4 ℃避光保存條件下，40 d后部分試紙條開始發(fā)生顏色變化。室溫避光條件下（18～27 ℃，抽屜中），30 d后試紙條變紅。試紙條在低溫和室溫保存效果有明顯差別，低溫保存時(shí)間較長(zhǎng)，效果較好，保存過程中注意避光。

表3 不同條件下試紙條保存后顏色變化

2.5 試紙盒的組裝

以硝酸纖維素膜（NC膜）為顯色區(qū)，玻璃纖維素膜為樣品墊（滴加檢測(cè)物：山梨酸鉀），聚酯纖維素膜為顯色劑墊（浸泡干燥后的TBA試紙），PVC膠板為底座，吸水墊為吸水濾紙加速樣品的流動(dòng)，見圖3和圖4。

圖3 試劑盒模型

圖4 試劑盒

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速檢測(cè)山梨酸鉀濃度的試紙條法，對(duì)其制備工藝條件及配方進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，采用硝酸纖維素膜、質(zhì)量濃度為16.0 g/L 的TBA溶液、浸泡時(shí)間5～10 min、干燥溫度37 ℃， 制備的試紙具有良好的性能。試紙法檢測(cè)山梨酸鉀僅需5～10 min，檢測(cè)靈敏度為1 g/L，具有樣品量小、反應(yīng)靈敏、成本低廉、使用方便和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的山梨酸鉀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法相比，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，其檢測(cè)范圍較大，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，是一種快速半定量檢測(cè)方法，在食品、發(fā)酵、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等產(chǎn)業(yè)中有良好的發(fā)展 前景。