水溶性檸檬苦素苯甲酰腙衍生物的合成及其抗菌活性

楊成偉，郭雅麗，李曹龍

（中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，南京 211198）

酰腙類化合物是由酰肼類化合物與羰基類化合物經(jīng)過(guò)脫水而成的一種席夫堿，具有較好的生物活性［1］，如抗結(jié)核［2］、抗菌［3］、抗蟲［4］等，在醫(yī)學(xué)、生物和農(nóng)藥等領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。

檸檬苦素是一種含有4，4，8-三甲基-17-呋喃甾體骨架的化合物，主要存在于蕓香料和楝科植物中［5］，具體結(jié)構(gòu)如圖1 所示，在D 環(huán)C-17 處連接一個(gè)呋喃環(huán)，同時(shí)在C-3，C-4，C-7，C-16 以及C-17連接含氧官能團(tuán)。研究表明，檸檬苦素及其類似物的A 環(huán)和B 環(huán)是其抗菌效果的關(guān)鍵位點(diǎn)［6］，具有潛在的研究?jī)r(jià)值，但因其水溶性不佳，生物利用率低［7］，因此，影響了其實(shí)際的應(yīng)用。

Figure 1 Chemical structure of limonin

為解決檸檬苦素水溶性較差和提高化合物的抗菌效果，本研究利用藥物設(shè)計(jì)中的拼合原理，在其7 位羰基處引入苯甲酰腙，合成了8 個(gè)檸檬苦素苯甲酰腙衍生物（7a～7h），并進(jìn)行了水溶性和抗菌活性研究。

1 合成路線

目標(biāo)化合物的7a～7h 的制備見路線1。由檸檬苦素（1）為起始原料與苯甲酰肼或取代的苯甲酰肼在甲醇中縮合，可得到相應(yīng)的酰腙目標(biāo)產(chǎn)物7a～7h。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

MSH-20D 型數(shù)顯磁力加熱攪拌器（大韓科學(xué)有限公司）；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DLSB-20/40 型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；AM-300 型核磁共振儀、AM-400 型核磁共振儀器、Esquire LC 型質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）；高效液相色譜儀（日本島津公司）。

Scheme 1 Synthetic route of water-soluble limonin benzoylhydrazone derivatives 7a-7h Reagents and conditions:a:Ar-CONHNH2,methanol,reflux

所有試劑均為分析純，檸檬苦素購(gòu)于成都儀睿生物科技有限公司，其余試劑購(gòu)于安耐吉化學(xué)。供試菌種：金黃色葡萄球菌（S. aureus，ATCC 3101）、大腸埃希菌（E. coli，ATCC 8735）均購(gòu)于上海滬崢生物科技有限公司。

2.2 合 成

目標(biāo)化合物的合成通法：稱取取代苯甲酰肼1.5 mmol 和檸檬苦素1 mmol 置于50 mL 圓底燒瓶中，加入甲醇20 mL，乙酸2 mL，升溫至70 ℃，攪拌反應(yīng)48 h，并用TLC 檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓去除溶劑后，用薄層硅膠色譜純化得到化合物7a～7h，產(chǎn)率為47%～73%。

化合物7a 白色固體，收率47%。mp 240～241 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：10.92（1H，s，NH-H），7.86（2H，d，J = 7.4 Hz，Ar-H），7.74（2H，s，23-H），7.68（1H，t，J=1.7 Hz，21-H），7.57（1H，m，Ar-H），7.51（2H，t，J=7.3 Hz，Ar-H），6.52（1H，s，22-H），5.46（1H，s，17-H），4.85（1H，d，J =13.0 Hz，19-H），4.43（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.10（2H，d，J = 5.0 Hz，1-H），2.95（1H，d，J =14.2 Hz，15-H），2.82（1H，d，J = 16.4 Hz，2-H），2.63（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.42（1H，d，J=14.8 Hz，6-H），2.19（1H，d，J=14.6 Hz，6-H），1.77（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.25（3H，d，J =4.6 Hz，25-H），1.18（3H，s，26-H），1.04（3H，s，24-H），1.00（s，3H，18-H）。分子式為：C33H36N2O8，HRESUMS m/z：589.254 1［M+H］+。

化合物7b 白色固體，收率73%。mp 205～206 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：10.83（1H，s，NH-H），7.77（2H，d，J = 8.0 Hz，Ar-H），7.74（2H，s，23-H），7.68（1H，t，J=1.7 Hz，21-H），7.31（2H，d，J=7.9 Hz，Ar-H），6.51（1H，s，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.84（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.43（1H，d，J=12.8 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），3.83（3H，s，OCH3-H），2.82（1H，d，J = 16.5 Hz，2-H），2.62（1H，dd，J = 16.4，4.0 Hz，2-H），2.18（1H，d，J = 14.2 Hz，6-H），1.88 ～1.71（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.23（3H，d，J = 3.6 Hz，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.03（3H，s，24-H），0.99（3H，s，18-H）。分子式為：C34H38N2O9，HR-ESUMS m/z：641.248 2［M+Na］+。

化合物7c 白色固體，收率51%。mp 242～244 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：10.77（1H，s，NH-H），7.85（2H，d，J = 8.4 Hz，Ar-H），7.74（3H，d，J=1.5 Hz，23-H），7.68（1H，t，J=1.8 Hz，21-H），7.04（2H，d，J = 8.7 Hz，Ar-H），6.51（1H，d，J=1.6 Hz，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.84（1H，d，J=13.1 Hz，19-H），4.43（1H，d，J=13.0 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），2.62（1H，dd，J = 16.6，4.0 Hz，2-H），2.38（3H，s，CH3-H），2.18（1H，d，J =14.6 Hz，6-H），1.76（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.22（3H，s，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.03（3H，s，24-H），0.99（3H，s，18-H）。 分 子 式 為：C34H38N2O8，HR-ESUMS m/z：625.252 6［M+Na］+。

化合物7d 白色固體，收率50%。mp 215～216 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：10.81（1H，s，NH-H），9.74（1H，s，OH-H），7.74（1H，d，J=1.4 Hz，23-H），7.68（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），7.29（2H，d，J = 5.5 Hz，Ar-H），7.22（1H，s，Ar-H），6.97 ～6.92（1H，m，Ar-H），6.55 ～6.49（1H，m，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.84（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.43（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.12（1H，s，1-H），2.62（1H，dd，J=16.4，3.9 Hz，2-H），2.40（1H，d，J = 14.6 Hz，6-H），2.18（1H，d，J = 14.5 Hz，6-H），1.77（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.20（6H，d，J = 14.8 Hz，25-H；26-H），1.01（6H，d，J =13.7 Hz，24-H；18-H）。分子式為：C33H36N2O9，HRESUMS m/z：627.231 9［M+Na］+。

化合物7e 白色固體，收率36%。mp 218～219 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：10.65（1H，s，NH-H），10.07（1H，s，OH-H），7.76（2H，d，Ar-H），7.74（2H，d，J=1.6 Hz，23-H），7.68（1H，t，J=1.7 Hz，21-H），6.85 ～6.81（2H，m，Ar-H），6.51（1H，dd，J = 2.0，0.8 Hz，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.83（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.42（1H，d，J=12.9 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），2.82（1H，d，J = 16.3 Hz，15-H），2.62（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.38（1H，d，J = 14.7 Hz，6-H），2.22 ～2.14（1H，m，6-H），1.76（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.23（3H，d，J=6.8 Hz，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.03（3H，s，24-H），0.99（3H，s，18-H）。分子式為：C33H36N2O9，HR-ESUMS m/z：627.232 2［M+Na］+。

化合物7f 白色固體，收率58%。mp 215～217 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：10.41（1H，s，NH-H），7.75 ～7.72（1H，m，23-H），7.68（1H，t，J=1.7 Hz，21-H），7.61（2H，d，J=8.6 Hz，Ar-H），6.57（2H，d，J = 8.6 Hz，Ar-H），6.51（1H，dd，J =2.0，0.8 Hz，22-H），5.73（2H，s，NH2-H），5.45（1H，s，17-H），4.82（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.42（1H，d，J=12.9 Hz，19-H），4.13（1H，s，1-H），3.17（1H，d，J = 5.2 Hz，15-H），2.91（1H，d，J =14.4 Hz，15-H），2.81（1H，d，J = 16.4 Hz，2-H），2.62（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.36（1H，d，J=14.7 Hz，6-H），2.17（1H，d，J=14.5 Hz，6-H），1.91（1H，s，5-H），1.75（4H，d，J = 9.0 Hz，11-H；12-H），1.22（3H，s，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.03（3H，s，24-H），0.98（3H，s，18-H）。分子式為：C33H37N3O8，HR-ESUMS m/z：626.248 0［M+Na］+。

化合物7g 白色固體，收率54%。mp 257～259 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：11.03（1H，s，NH-H），7.90（1H，s，Ar-H），7.83（1H，d，J = 7.4 Hz，Ar-H），7.74（1H，s，23-H），7.68（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），7.64（1H，s，Ar-H），7.55（1H，t，J = 7.8 Hz，Ar-H），6.51（1H，s，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.85（1H，d，J = 12.9 Hz，19-H），4.43（1H，d，J =12.9 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），2.87（1H，d，J=15.0 Hz，15-H），2.76（1H，d，J = 16.7 Hz，2-H），2.63（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.42（1H，d，J=14.9 Hz，6-H），2.18（1H，d，J=14.4 Hz，6-H），1.77（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.24 ～1.23（3H，m，25-H），1.18（3H，s，26-H），1.04（3H，s，24-H），1.00（3H，s，18-H）. 分子式為：C33H35ClN2O8，HRESUMS m/z：645.202 1［M+Na］+。

化合物7h 白色固體，收率51%。mp 210～212 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：10.99（1H，s，NH-H），7.89（2H，d，J = 8.2 Hz，Ar-H），7.73（1H，s，23-H），7.67（1H，t，J=1.7 Hz，21-H），7.58（2H，d，J=8.1 Hz，Ar-H），6.51（1H，s，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.85（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.42（1H，d，J=13.0 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），2.87（1H，d，J = 15.3 Hz，15-H），2.76（1H，d，J =16.2 Hz，2-H），2.63（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.41（1H，d，J = 14.9 Hz，6-H），2.18（1H，d，J= 14.2 Hz，6-H），1.77（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.24（3H，d，J=3.6 Hz，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.04（3H，s，24-H），0.99（3H，s，18-H）. 分子式為：C33H35ClN2O8，HR-ESUMS m/z：645.198 5［M+Na］+。

2.3 合成化合物水溶性測(cè)試

2.3.1 對(duì)照品溶液的配制 將化合物7a～7h 精密稱量2.0 mg，置于10 mL 量瓶中，加入適量甲醇振蕩溶解后，加甲醇至刻度搖勻，即得到母液（200 mg/L）。將上述母液進(jìn)行倍半稀釋，待用。

2.3.2 供試品溶液的配制 精密稱量化合物7a～7h 2.0 mg，加入蒸餾水2 mL 超聲溶解30 min 后，過(guò)0.25 μm微孔濾膜除去未溶解的雜質(zhì)，即得該化合物在室溫下的飽和溶液。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取不同質(zhì)量濃度的7a～7h 對(duì)照品溶液20 μL 注入液相色譜儀，檢測(cè)波長(zhǎng)選定為230 nm，流動(dòng)相選用乙腈-水（1∶1），流速控制在1.0 mL/min，柱溫選擇常溫，保留時(shí)間為10 min，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，得到相應(yīng)的回歸方程。并取供試品溶液20 μL 注入液相色譜儀，在同一色譜條件下，記錄峰面積，從而計(jì)算得出該化合物在室溫下在水中的溶解度。

2.4 抗菌活性測(cè)試

選用革蘭陽(yáng)性菌S.aureus和革蘭陰性菌E.coli為實(shí)驗(yàn)菌株。以甲醇為溶劑，將合成的化合物和檸檬苦素分別配成5 mg/mL 的溶液，將溶液通過(guò)0.22 μm 濾膜濾入無(wú)菌離心管中，將足量的無(wú)菌濾紙片（6 mm）浸泡于溶液中，充分浸泡4 h 后備用。取含有1×107～1×109CFU/mL 的菌液20 μL，均勻涂布在配好的平板牛肉膏固體培養(yǎng)皿中，用涂布棒將菌液分布均勻備用。將浸泡后的無(wú)菌濾紙片放置于涂布菌液的平板培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，量取抑菌圈直徑，記錄平均值。根據(jù)文獻(xiàn)中的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)［8］將發(fā)現(xiàn)的高敏化合物，采用平皿二倍稀釋法，來(lái)測(cè)定活性化合物的最低抑菌濃度（MIC），并與檸檬苦素和苯甲酸鈉進(jìn)行比較。

3 結(jié)果與討論

3.1 檸檬苦素水溶性衍生物的合成

酰腙的合成是有由羰基和酰肼反應(yīng)生成的，一般情況下會(huì)選用強(qiáng)酸作催化劑，在醇溶液中進(jìn)行，但由于檸檬苦素在乙醇中的溶解度低于甲醇，且其結(jié)構(gòu)中A環(huán)和B環(huán)存在兩個(gè)內(nèi)酯環(huán)，在酸性過(guò)強(qiáng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致其開環(huán)，因此在合成中需要選擇使用甲醇作溶劑和酸性不強(qiáng)的乙酸做催化劑。此外，反應(yīng)溫度的控制也較為關(guān)鍵，試驗(yàn)表明，當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)90 ℃時(shí)會(huì)導(dǎo)致檸檬苦素的內(nèi)酯環(huán)在酸性條件下和溶劑發(fā)生醇解，使得副產(chǎn)物增多。反應(yīng)結(jié)束后，用硅膠柱以甲醇-二氯甲烷（1∶200）即可分離得到純品化合物。

3.2 水溶性測(cè)定結(jié)果

吸取化合物7a～7h 供試液20 μL 注入高效液相色譜儀，檢測(cè)波長(zhǎng)選定為230 nm，流動(dòng)相選用乙腈-水（1∶1），流速在1.0 mL/min ，柱溫選擇常溫，保留時(shí)間為10 min，記錄峰面積，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即得該化合物在室溫下（25 ℃）水中的溶解度。計(jì)算結(jié)果見表1。

從表1 可以看出，檸檬苦素的7 位羰基處引入苯甲酰腙基團(tuán)后，水溶性顯著提升，其中化合物7a，7d，7e，7f較為明顯，化合物7f水溶性最強(qiáng)。

3.3 抑菌活性

采用濾紙片法測(cè)定所合成的化合物在5 mg/mL下的抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)抑菌圈大小進(jìn)行判斷，所合成的化合物7d，7e對(duì)兩種菌株都有一定的抑制活性，其中化合物7d 對(duì)S. aureus和E. coli表現(xiàn)為中度敏感，化合物7e 對(duì)S. aureus和E. coli表現(xiàn)為高度敏感，而化合物7a 和7f，僅對(duì)S.aureus表現(xiàn)中度敏感。

用無(wú)菌甲醇或無(wú)菌水溶解化合物7e、檸檬苦素和苯甲酸鈉制得母液，并用LB 培養(yǎng)基以二倍稀釋法分別稀釋，得到終濃度分別為10.00，5.00，2.50，1.25，0.62和0.31 mg/mL的含藥平板。在含藥平板上接種每毫升含菌數(shù)約1×107個(gè)的S.aureus和E.coli的培養(yǎng)液20 μL，于細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察生長(zhǎng)結(jié)果，無(wú)菌生長(zhǎng)的平板中所含藥物最小濃度即為最低抑菌濃度（MIC），其結(jié)果見表3。

Table 2 Diameter of bacteriostatic circle for the compounds 7a-7h in 5 mg/mL(± s,n = 3)

Table 2 Diameter of bacteriostatic circle for the compounds 7a-7h in 5 mg/mL(± s,n = 3)

"-"indicates no bacteriostatic activity

?

Table 3 Comparison of MIC between compound 7e and sodium benzoate

從表2 可以看出，化合物7d、7e 對(duì)兩種菌株有抑制活性，化合物7a、7d、7f 僅對(duì)S. aureus有抑制活性，結(jié)合表3 可以得出，化合物7e 對(duì)E.coli的抑菌效果優(yōu)于苯甲酸鈉，對(duì)S.aureus的抑菌效果要弱于苯甲酸鈉，但化合物7e 相較檸檬苦素在抗S.aureus和E.coli的效果上均有明顯的提升。

綜上所述，從總體構(gòu)效關(guān)系來(lái)看，苯甲酰腙基的引入可以提升檸檬苦素抗S.aureus和E.coli的活性，該結(jié)果也與之前相關(guān)的報(bào)道一致［9］。結(jié)合化合物在苯環(huán)上的同一位置取代基的種類來(lái)看，在苯環(huán)間位和對(duì)位上的有氯取代的化合物（7g 和7h），抗S.aureus和E.coli的活性較差；苯環(huán)對(duì)位上取代甲基和甲氧基的化合物（7b 和7c），在抗S.aureus和E. coli的活性上，未表現(xiàn)出積極的影響；而在苯環(huán)間位和對(duì)位上取代羥基后的化合物（7d和7e），其抗S. aureus和E. coli的活性有較顯著的增強(qiáng)，其中化合物7e 在抗E. coli的活性強(qiáng)于苯甲酸鈉。結(jié)合取代基在苯環(huán)上的位置來(lái)看，在苯環(huán)上間位的氯取代（7g）未改變化合物對(duì)S. aureu的抗菌活性；在苯環(huán)的間位的羥基取代（7d）則降低了化合物對(duì)S.aureus和E.coli的抗菌活性，其深入的構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。