鹽炙杜仲對大鼠腎陽虛的影響及機(jī)制研究

程芬 楊長花 宋艷麗 杜蓓 劉峰 胡本祥

關(guān)鍵詞鹽炙杜仲;腎陽虛;大鼠;缺氧誘導(dǎo)因子1α;信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子5

腎陽虛是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的常見證型之一，多與素體陽虛、年老腎虧、久病不愈等因素密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腎陽虛會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、軟骨退變及生殖能力減退等多種病理性改變，如不及時(shí)治療會(huì)嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量[2]。目前，臨床尚無針對腎陽虛的系統(tǒng)治療藥物，只能進(jìn)行基礎(chǔ)的對癥治療，所以相關(guān)治療藥物的研發(fā)是當(dāng)前工作重點(diǎn)[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎主水，腎陽虛的臨床表現(xiàn)主要呈小便清長等特征，故有學(xué)者結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，腎陽虛與腎組織病理學(xué)變化有關(guān)[3]。杜仲可通過增強(qiáng)或提高腎陽虛小鼠抓力、肛溫、自主活動(dòng)能力、睪丸和精囊腺指數(shù)，延長其游泳時(shí)間，降低其血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCR）水平，改善其血液學(xué)指標(biāo)來改善其腎陽虛證之腰膝酸軟、性欲減退、畏寒、肢冷、精神萎靡、陽虛水泛以及腎精虧虛、肝氣虛弱所致的血液虧虛[4]。鹽炙杜仲對大鼠去卵巢所引起的骨質(zhì)疏松癥有良好的干預(yù)作用，且鹽制品效果優(yōu)于生品[5]。杜仲鹽炙后，能改變其大多數(shù)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，增加親脂性，從而促進(jìn)其體內(nèi)吸收，提高生物利用度[6]。然而目前鹽炙杜仲在腎陽虛方面的藥理作用及機(jī)制尚不明確。有研究報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子5（signal transducer and activator of transcription5，STAT5）信號通路及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化與腎陽虛的發(fā)病機(jī)制及患者預(yù)后密切相關(guān)，調(diào)控HIF-1 α和STAT5 蛋白的表達(dá)可能是治療腎陽虛的重要途徑和方法[7-8]?；诖?，本研究擬初步探討鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠的干預(yù)作用及潛在機(jī)制，為鹽炙杜仲藥理作用的深入研究及腎陽虛治療藥物的研發(fā)提供新的思路和參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SD1-BS 型全自動(dòng)生化分析儀（成都斯馬特科技公司）、Axio Imager M2m型倒置顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司）、ChemiDoc XRS型凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）、ST-960 型多功能酶標(biāo)儀（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）、GL-20MS型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、DYCZ-30C型雙垂直電泳槽（北京海天友誠科技公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鹽炙杜仲（北京同仁堂制藥有限公司，批號1908161），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院胡本祥教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.干燥樹皮的鹽制品;桂附地黃片[陽性對照藥，批號1806192，規(guī)格0.4 g（相當(dāng)于總藥材1 g）]購自太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司;磷酸腺嘌呤片（批號1811271，規(guī)格10 mg）購自天津力生制藥股份有限公司;超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）檢測試劑盒（貨號S0103）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（貨號S0131M）、睪酮（testosterone，T）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號PT872）、RIPA蛋白裂解液（貨號P0013B）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號P0018M）、兔源HIF-1 α多克隆抗體（貨號PT872）、兔源甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（貨號AF7087）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（貨號A0208）均購自上海碧云天生物科技有限公司;皮質(zhì)醇（cortisol，COR）ELISA 試劑盒（貨號KB3114）購自上海恪敏生物科技有限公司;兔源STAT5 及磷酸化STAT5（phosphorylatedSTAT5，p-STAT5）多克隆抗體（ 貨號分別為ab16276、ab178941）均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司;蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液試劑盒（貨號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒（貨號WLA088）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（貨號WLA071）均購自沈陽萬類生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級雄性SD 大鼠共90 只，6～8 周齡，體質(zhì)量為180～200 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號為SYXK（陜）2018-001。所有大鼠均飼養(yǎng)在溫度（22±2）℃、相對濕度40%～60%的動(dòng)物房內(nèi)，自由攝食、飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)陜西國際商貿(mào)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，批準(zhǔn)號為201940。

2 方法

2.1 鹽炙杜仲混懸液的制備

取鹽炙杜仲300 g，粉碎，得粗粉，取適量，置于60%乙醇1 000 mL中，回流提取1.5 h×2 次，合并提取液，加熱濃縮制成質(zhì)量濃度為3 g/mL（以生藥量計(jì)）的浸膏，備用。使用時(shí)，將上述浸膏用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.6、0.3、0.15 g/mL（以生藥量計(jì)）的混懸液。

2.2 造模與給藥

90 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，稱定其體質(zhì)量（記為W1）。按體質(zhì)量均衡和隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組（15 只）和造模組（75 只）。除正常對照組外，其余大鼠每天上午灌胃腺嘌呤250 mg/kg 建立腎陽虛大鼠模型，連續(xù)給藥14 d[9]。根據(jù)中醫(yī)理論觀察大鼠是否出現(xiàn)如下癥狀：（1）精神萎靡、畏寒;（2）活動(dòng)減少、蜷縮抱團(tuán);（3）大便溏稀、小便清長、肛周污穢;（4）體毛疏松、黯淡無光等。根據(jù)上述癥狀對各組大鼠腎陽虛癥候進(jìn)行評分：未出現(xiàn)以上癥狀記0 分，出現(xiàn)1 項(xiàng)癥狀記1 分，出現(xiàn)2 項(xiàng)癥狀記2 分，出現(xiàn)3 項(xiàng)癥狀記3 分，出現(xiàn)4 項(xiàng)癥狀記4 分;以大鼠腎陽虛癥候評分大于0 分并伴有血清T 水平降低、COR水平升高視為造模成功[10]。造模完成后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組和鹽炙杜仲低、中、高劑量組，每組15 只。陽性對照組大鼠灌胃桂附地黃片混懸液2.5 g/kg（溶劑為水）[9]，鹽炙杜仲低、中、高劑量組大鼠分別灌胃鹽炙杜仲混懸液1.5、3、6 g/kg[11]，正常對照組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，每天1 次，連續(xù)給藥8周[10]。給藥結(jié)束后，對各組大鼠的腎陽虛癥候進(jìn)行評分并再次稱定其體質(zhì)量（記為W2）。

2.3 大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平測定

取材前，大鼠禁食不禁水12 h。末次給藥1 h 后，取大鼠眼眶靜脈叢血，于4 ℃下靜置4 h 后，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀測定血清中BUN、SCR水平;嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書方法操作，檢測血清中T、COR水平。

2.4 大鼠腎組織病理學(xué)檢查

取血后，大鼠頸椎脫臼處死，取腎組織適量，用中性甲醛固定后，浸蠟、切片（厚度5 μm），常規(guī)HE染色后，使用倒置顯微鏡觀察其腎組織病理學(xué)變化。

2.5 大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平檢測

取大鼠腎組織適量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法操作，以WST-8 法檢測各組大鼠腎組織中SOD活性，顯色法檢測腎組織中MDA水平。

2.6 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA表達(dá)檢測

取大鼠腎組織適量，提取總RNA 后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用熒光定量PCR 法檢測其HIF-1 α 、STAT5mRNA的表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）包含cDNA模版2 μL，PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，用無菌水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。引物由賽默飛世爾科技有限公司設(shè)計(jì)、合成，其具體序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HIF-1α、STAT5 mRNA的相對表達(dá)量。

2.7 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5蛋白表達(dá)檢測

采用Western blot 法進(jìn)行檢測。取大鼠腎組織適量，經(jīng)RIPA蛋白裂解液提取總蛋白后，按BCA法定量，然后加熱變性，取變性后的蛋白樣品50 μg 進(jìn)行電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，用脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，置于4 ℃ 冰箱中，加入HIF-1 α 、STAT5、p-STAT5、GAPDH 一抗（稀釋比例均為1 ∶ 500），孵育過夜;使用PBST 緩沖液清洗3 次，共15 min，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1 ∶1 000），室溫孵育1 h，用PBST緩沖液清洗3 次，以ECL 顯色后，于凝膠成像儀上成像并使用Image J 1.52v 軟件分析蛋白灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值為該蛋白的相對表達(dá)量，以p-STAT5 與STAT5 的灰度值比值（p-STAT5/STAT5）評價(jià)STAT5蛋白的磷酸化水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料（符合正態(tài)分布）以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量變化及腎陽虛癥候評分

鹽炙杜仲對大鼠體質(zhì)量及腎陽虛癥候評分的影響見表2。由表2 可見，造模前，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。給藥結(jié)束后，模型組大鼠的體質(zhì)量較正常對照組顯著降低（P<0.05），腎陽虛癥候評分顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠的體質(zhì)量均較模型組顯著升高（P<0.05），腎陽虛癥候評分均顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.2 大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平變化

鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平的影響見表3。由表3 可見，模型組大鼠血清中BUN、SCR、COR 水平均較正常對照組顯著升高（P<0.05），T水平顯著降低（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠血清中BUN、SCR、COR水平均較模型組顯著降低（P<0.05），T水平均顯著升高（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.3 大鼠腎組織病理變化

各組大鼠腎組織病理檢查的顯微圖見圖1。由圖1可見，正常對照組大鼠腎組織細(xì)胞排列整齊，未見明顯病理改變;與正常對照組比較，模型組大鼠腎小管壞死，腎小球數(shù)量減少、囊腔增大，炎癥細(xì)胞增生;與模型組比較，鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠腎小球及腎小管的病理改變均有所恢復(fù)，腎組織細(xì)胞排列均較為整齊，炎癥細(xì)胞浸潤均明顯減輕。

3.4 大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平變化

鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平的影響見表4。由表4 可見，模型組大鼠腎組織中SOD活性較正常對照組顯著降低（P<0.05），MDA水平顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠腎組織中SOD 活性均較模型組顯著升高（P<0.05），MDA水平均顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.5 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA相對表達(dá)量變化

鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5mRNA相對表達(dá)量的影響見表5。由表5 可見，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA的相對表達(dá)量均較正常對照組顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA的相對表達(dá)量均較模型組顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.6 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5蛋白表達(dá)變化

各組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠腎組織中HIF-1 α、STAT5、p-STAT5 蛋白相對表達(dá)量和p-STAT5/STAT5 的影響見表6。由圖2、表6 可見，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對表達(dá)量和p-STAT5/STAT5 均較正常對照組顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽性對照組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對表達(dá)量和p-STAT5/STAT均較模型組顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

4 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，腎陽虛是由機(jī)體腎陽虛衰、溫煦失職、氣化失權(quán)等病因所導(dǎo)致的畏寒怕冷、精神不振等一系列癥候[12-13]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腎陽虛發(fā)病機(jī)制與腦、腎、性腺等組織器官神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂等因素相關(guān)[14]。腺嘌呤致腎陽虛是目前實(shí)驗(yàn)室常用的腎陽虛動(dòng)物模型建立方法，經(jīng)實(shí)踐證實(shí)，該方法具有操作簡便、安全性及重復(fù)性較好的優(yōu)點(diǎn)[15]。桂附地黃片是臨床應(yīng)用較為廣泛的腎陽虛治療藥物，故本研究將其作為陽性對照藥。

杜仲為杜仲科植物杜仲E. ulmoides Oliv.的干燥樹皮，最早記載于我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有強(qiáng)筋壯骨、補(bǔ)益肝腎等功效，可用于治療腎陽虛致腰膝酸痛等癥[16]。鹽炙杜仲是杜仲藥材經(jīng)一系列加工工藝所制得的中藥炮制品，與傳統(tǒng)杜仲藥材相比，鹽炙杜仲具有更強(qiáng)的抗氧化能力，并可緩和生品藥性[17]。

腎陽虛癥候評分是研究者對腎陽虛大鼠造模效果評價(jià)及藥效學(xué)評價(jià)的重要手段之一[18]。BUN、SCR水平是反映腎功能的重要指標(biāo)，其水平升高提示腎功能下降[19]。近年來有學(xué)者提出，下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)激素水平能夠反映腎陽虛疾病狀態(tài)及病情進(jìn)展，血清中T、COR水平是下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)激素的代表，血清中T 水平降低及COR水平升高則是腎陽虛的重要表現(xiàn)之一[20]。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，鹽炙杜仲各劑量組大鼠腎小球及腎小管的病理改變均有所恢復(fù)，其腎陽虛癥候評分和血清中BUN、SCR、COR水平均顯著降低，血清中T 水平均顯著升高，且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性，提示該炮制品能劑量依賴性地改善腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠腎組織病理改變和下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)激素水平。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與腎陽虛的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展密切相關(guān)[21]。陳琪琪等[22]研究顯示，腺嘌呤會(huì)引發(fā)大鼠腎動(dòng)脈血管鈣化、腎小球萎縮及腎間質(zhì)纖維化等腎組織病理改變，其機(jī)制可能與HIF-1α水平升高有關(guān);孔翠文等[23]研究顯示，腺嘌呤可誘導(dǎo)大鼠腎組織缺氧損傷、腎纖維化改變以及腎組織中HIF-1α水平升高;賈云波等[24]研究顯示，降低HIF-1α水平能夠有效改善腎陽虛大鼠的血瘀證。STAT5 蛋白在生殖細(xì)胞發(fā)育和性激素水平調(diào)節(jié)的過程中有重要意義，其表達(dá)的上調(diào)會(huì)造成機(jī)體性激素水平的異常[25]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)鹽炙杜仲干預(yù)后，腎陽虛大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA及HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對表達(dá)量和p-STAT5/STAT5 均顯著降低，表明鹽炙杜仲不僅能顯著降低HIF-1α水平，還能夠顯著降低STAT5 蛋白的表達(dá)水平及其磷酸化水平，提示鹽炙杜仲對腎陽虛大鼠的改善作用可能是通過下調(diào)HIF-1α和STAT5蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

SOD及MDA是體現(xiàn)抗氧化應(yīng)激能力的指標(biāo)。研究表明，SOD活性降低、MDA水平升高均會(huì)導(dǎo)致腎組織處于氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)，同時(shí)導(dǎo)致腎組織中HIF-1α水平升高[26];馮杰等[27]研究顯示，抑制MDA的產(chǎn)生和增強(qiáng)SOD的活性，可抑制腎組織中HIF-1α的表達(dá)水平，從而修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎組織損傷。本研究結(jié)果表明，不同劑量的鹽炙杜仲均能增強(qiáng)大鼠腎組織中SOD活性并降低MDA水平，提示鹽炙杜仲能夠通過提高大鼠的抗氧化應(yīng)激能力進(jìn)而修復(fù)腎陽虛大鼠的腎組織損傷，同時(shí)抑制HIF-1α的表達(dá)。

綜上所述，鹽炙杜仲能夠明顯緩解腎陽虛大鼠的腎組織損傷，降低血清中BUN、SCR、COR水平，升高血清中T 水平，其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激、抑制HIF-1 α和STAT5 蛋白的表達(dá)有關(guān)。