高壓液相色譜法同時(shí)測定泌感合劑中6種黃酮類成分研究

彭敏 符映均 童曉東 姜曉燕 楊水英 劉忠美 倪紅輝 張碩

摘要 目的：建立高壓液相色譜法（HPLC）同時(shí)分析并測定泌感合劑中落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素的含量。方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.4%磷酸水（B），梯度洗脫;檢測波長320 nm;流速1.0 mL/min;柱溫23 ℃。結(jié)果：落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素分別在0.144～1.44 μg（r=0.999 9）、0.196～1.96 μg（r=0.999 7）、0.076～0.76 μg（r=0.999 3）、0.034～0.34 μg（r=0.999 3）、0.032～0.32 μg（r=0.999 8）、0.026～0.26 μg（r=0.999 5）范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好;平均回收率在分別為95.6%、96.3%、94.5%、92.3%、97.8%、95.2%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.7%、1.5%、2.2%、1.2%、2.0%、1.6%。結(jié)論：該方法操作簡單、穩(wěn)定、可重復(fù)，可用于同時(shí)分析測定泌感合劑中6種黃酮類成分的含量。

關(guān)鍵詞 泌感合劑;落新婦苷;野黃芩苷;野黃芩素;木犀草素;芹菜素;異鼠李素;高壓液相色譜法;含量測定

Simultaneous Determination of Six Flavonoids in Migan Mixture by HPLC

PENG Min，F(xiàn)U Yingjun，TONG Xiaodong，JIANG Xiaoyan，YANG Shuiying，LIU Zhongmei，NI Honghui，ZHANG Shuo

（Nantong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Province，Nantong 226000，China）

Abstract Objective：To develop a method for simultaneous determination of astilbin，scutellarin，scutellarein，luteolin，apigenin，and isorhamnetin in Migan Mixture by high-performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：Separation was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm） at 23 ℃.The mobile phases were methanol（A）-0.4% phosphoric acid（B） with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1 and the detection wavelength was 320 nm.Results：Astilbin，scutellarin，scutellarein，luteolin，apigenin，and isorhamnetin showed good linearity between the injection volume and the peak area at 0.144～1.44 μg（r=0.999 9），0.196～1.96 μg（r=0.999 7），0.076～0.76 μg（r=0.999 3），0.034～0.34 μg（r=0.999 3），0.032～0.32 μg（r=0.999 8），and 0.026～0.26 μg（r=0.999 5），respectively.The average recoveries were 95.6%，96.3%，94.5%，92.3%，97.8%，and 95.2%，with RSDs of 1.7%，1.5%，2.2%，1.2%，2.0%，and 1.6%，respectively.Conclusion：This method is simple，stable，and repeatable，which can be used to determine the content of six flavonoids in Migan Mixture by HPLC.

Keywords Migan Mixture; Astilbin; Scutellarin; Scutellarein; Luteolin; Apigenin; Isorhamnetin; High-performance liquid chromatography; Simultaneous determination

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.10.004

泌感合劑是由白花蛇舌草、金錢草、半枝蓮、地榆、土茯苓、炒知母等八味藥材制備而成的中藥合劑，屬于南通市中醫(yī)院自制制劑。用于治療濕熱引起的淋癥、帶下，對(duì)腎盂腎炎、尿道炎引起的尿急、尿頻、尿痛，宮頸炎引起的陰道刺癢、帶下有較好的治療作用[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)是泌感合劑的主要藥效物質(zhì)[2]，其中野黃芩苷[3]、落新婦苷[4]、木犀草素[5-6]、野黃芩素[7]等均具有抗炎、抗氧化作用。2015版《中華人民共和國藥典》中，野黃芩苷、落新婦苷分別是半枝蓮、土茯苓的指標(biāo)性成分[8];研究表明，野黃芩素、木樨草素、芹菜素、異鼠李素也是半枝蓮黃酮成分的特征組成[9-10]。

本課題前期測定了總黃酮及其代表物質(zhì)山柰素、槲皮素的含量[2，11]，但這并不足以反應(yīng)制劑的質(zhì)量，現(xiàn)結(jié)合黃酮類有效組分研究與《中華人民共和國藥典》含量測定方法，同時(shí)測定落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素的含量，以期從多成分、協(xié)同作用的角度，更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（配DAD檢測器，賽默飛世爾科技有限公司，美國，型號(hào)：DIONEX-UltiMate 3000）;分析天平（梅特勒-托利多有限公司，瑞士，型號(hào)：MS105D）。

1.2 試劑 對(duì)照品落新婦苷（批號(hào)：111798-201504）、野黃芩苷（批號(hào)110842-201709）、木犀草素（批號(hào)：111520-201605）、芹菜素（批號(hào)：111901-201603），購自中國食品藥品檢定研究院;異鼠李素（批號(hào)：YZ093020）、野黃芩素（批號(hào)：YZ094015），購自南京源植生物科技有限公司。水為超純水;甲醇為色譜純;乙酸乙酯、磷酸等均為分析純。

1.3 分析樣品 泌感合劑為本院制劑（批號(hào)：20171023、20180413、20180821）;藥材金錢草（批號(hào)：170830）、白花蛇舌草（批號(hào)：180602）、半枝蓮（批號(hào)：180731）、川牛膝（批號(hào)：170518）、土茯苓（批號(hào)：180912）、地榆（批號(hào)：180304）、炒知母（批號(hào)：181114）、炒黃柏（批號(hào)：180613），均購自南通三越中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇（A）-0.4%磷酸水（B），洗脫梯度（0～25 min，29%A;26～35 min，36%A;36～42 min，38%A;43～66 min，48%A;67～78 min，53%A）流速為1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL;柱溫：23 ℃，檢測波長320 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品0.72 mg、0.98 mg、0.38 mg、0.17 mg、0.16 mg、0.13 mg，置于容量瓶中，加70%甲醇定容至20 mL。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取泌感合劑20 mL，加入濃鹽酸0.3 mL，100 ℃水浴回流1 h，靜置至室溫，用乙酸乙酯萃取3次，每次50 mL[2]。取乙酸乙酯層，合并萃取液，倒入蒸發(fā)皿中水浴蒸干，冷卻后用70%甲醇溶液定容至20 mL容量瓶中。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按泌感合劑處方工藝，照“2.3”項(xiàng)下的方法分別制備缺土茯苓、缺半枝蓮的陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果各成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰均大于3 000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液4 μL、8 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性方程。見表1。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。結(jié)果落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素的RSD分別為0.17%、0.16%、1.4%、0.56%、0.53%、0.29%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取泌感合劑（批號(hào)：20180821）20 mL，按照“2.3”項(xiàng)下的方法，制備成供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h分別進(jìn)樣，并記錄峰面積值。計(jì)算得落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.76%、0.62%、1.55%、1.24%、1.84%、1.27%，表明泌感合劑在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取泌感合劑（批號(hào)：20180821）6份，每份20 mL，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素含量的RSD分別為1.63%、1.22%、1.68%、1.49%、0.88%、1.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn) 精密量取6份已知含量的泌感合劑（批號(hào)：20180821，落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素含量依次為0.040 8、0.116 4、0.040 2、0.005 6、0.014 9、0.010 2 mg/mL），每份10 mL，加入適量對(duì)照品，按照“2.3”項(xiàng)下的方法制備成加樣供試品溶液，并以“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并分別計(jì)算含量及加樣回收率。見表2。

2.11 樣品測定結(jié)果 取泌感合劑三批（批號(hào)：20171023、20180413、20180821），每批2份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并以“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，每批樣品平行測3次。計(jì)算每批樣品中落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素、異鼠李素的平均含量。見表3。

3 討論

泌感合劑具有良好的清熱解毒功效，這種功效可能主要來源于其中半枝蓮、土茯苓、白花蛇舌草、金錢草等所含的黃酮類成分[12-15]。本研究在原有制劑標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上對(duì)這類成分進(jìn)一步分析，除了槲皮素與山柰素外[2]，泌感合劑還含有綠原酸、咖啡酸、花旗松素、芹菜素、落新婦苷、野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、異鼠李素等組分。盡管其中綠原酸、咖啡酸、花旗松素具有顯著的抗炎、抗菌、抗氧化作用[16-18]，但是在既定色譜條件下，綠原酸、咖啡酸專屬性較差，花旗松素分離度較差，均無法用于含量測定。

本實(shí)驗(yàn)研究的6種黃酮類成分吸收波長差異較大，落新婦苷在292 nm有最大吸收[19]，野黃芩苷、野黃芩素、芹菜素在330 nm有最大吸收[20]，木犀草素、異鼠李素在360 nm有最大吸收[21]。考慮落新婦苷的分離度、各個(gè)目標(biāo)成分的峰型對(duì)稱性、陰性干擾及基線的平穩(wěn)程度，分別比較了泌感合劑梯度洗脫過程中不同時(shí)段在290 nm、300 nm、320 nm、360 nm的色譜行為，最終選擇320 nm為整個(gè)梯度洗脫過程的檢測波長。盡管單一波長檢測能夠兼顧6種成分，但是多波長檢測可能靈敏度、專屬性更高。

在高效液相色譜中，柱溫是影響柱效及分離度的重要因素，偏高的柱溫能在一定程度上提高柱效，縮短分離時(shí)間，但會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)相似的成分之間的分離度降低。本實(shí)驗(yàn)先后比較過25 ℃、30 ℃、35 ℃條件下的色譜行為，發(fā)現(xiàn)芹菜素與異鼠李素的分離度均較差，柱溫降到23 ℃后，峰型顯著改善。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了泌感合劑其中可用于含量測定的6種黃酮類成分，方法穩(wěn)定、可靠，從多成分、多靶點(diǎn)的角度對(duì)泌感合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做出補(bǔ)充，有利于更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1]章海濤.泌感合劑治療非淋菌性尿道炎的體會(huì)[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2009，28（24）：22.

[2]符映均，石美琴，姜曉燕，等.泌感合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2017，31（6）：65-67.

[3]姜蔚.野黃芩苷藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2018，34（12）：1634-1637.

[4]李玉琪，袁婷婷，茅風(fēng)燕，等.落新婦苷的藥理活性及植物來源研究進(jìn)展[J].中國藥房，2017，28（19）：2718-2723.

[5]于倩，巫冠中.木犀草素抗炎機(jī)制的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)研究，2019，38（2）：108-111，119.

[6]趙長祺，趙耀紅，于海龍.木犀草素對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞體外增殖及凋亡的作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（22）：133-137.

[7]楊陽，蔣翠花，金喬梅，等.野黃芩素對(duì)大鼠急性咽炎的治療作用[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，50（5）：600-605.

[8]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：18，118.

[9]王治陽，安華.HPLC同時(shí)測定不同產(chǎn)地半枝蓮中8個(gè)黃酮類成分的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2017，19（7）：978-982，1000.

[10]田宇柔，馮玉，麻景梅，等.半枝蓮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（7）：851-857.

[11]符映均，胡浩彬，彭敏，等.泌感合劑中槲皮素和山柰素含量測定及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].藥學(xué)與臨床研究，2018，26（5）：324-326.

[12]李娜，王平，孫鐵鋒，等.半枝蓮化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2020，45（21）：5117-5128.

[13]雍晨，魯璐，汪悅.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究土茯苓的活性成分及藥理機(jī)制[J].遼寧中醫(yī)雜志，2019，46（9）：1926-1930.

[14]王信，馬傳江，楊培民，等.白花蛇舌草抗炎、抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2020，37（19）：2420-2426.

[15]楊欣，李亞輝，李來來，等.廣金錢草揮發(fā)油基于TRP通道的抗炎作用研究[J].中草藥，2019，50（1）：134-141.

[16]周祎，郜紅利.HPLC-DAD法同時(shí)測定中藥金錢草中6種活性成分的含量[J].中國藥師，2016，19（8）：1609-1611.

[17]段和祥，劉緒平，陳希，等.HPLC法同時(shí)測定白花蛇舌草中6種有機(jī)酸類成分的含量[J].中藥材，2019，42（8）：1842-1845.

[18]蔣思怡，宋小英，張丹丹，等.菝葜UPLC指紋圖譜與其抗大鼠盆腔炎作用的譜效關(guān)系研究[J].中國中藥雜志，2019，44（15）：3323-3329.

[19]嚴(yán)愛娟，張文婷，趙維良，等.土茯苓黃酮類成分一測多評(píng)方法的建立及含量變化規(guī)律研究[J].中草藥，2018，49（15）：3681-3686.

[20]夏云嶺，張振凌，張洪坤，等.HPLC法同時(shí)測定半枝蓮飲片中4種黃酮類成分的含量及主成分分析[J].中國藥房，2019，30（20）：2839-2844.

[21]王寧寧，鄭文惠，張凱雪，等.沙棘的化學(xué)成分、藥理作用研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測分析[J].中國中藥雜志，2021，46（21）：5522-5532.

（2020-02-04收稿 本文編輯：吳珊）