不同香型白酒對斑馬魚醉酒行為的影響

陳欣怡，丁子元，劉永泉，余枚珠，夏 冰，鄭曉衛(wèi)，*

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南 湘西土家族苗族自治州 416000）

白酒具有社交產(chǎn)品的本質(zhì)屬性，一直以來承載了人們的情感交流和文化傳承[1]。中國是白酒的生產(chǎn)和消費(fèi)大國，白酒對人體健康的作用說法不一[2]。飲酒不當(dāng)會引發(fā)社會問題，也會導(dǎo)致過早死亡和多種疾病等危險[3]。隨著社會老齡化和人們健康意識的不斷提高，人們對于白酒的消費(fèi)逐漸從感性走向了理性[4]。人們對飲酒滿足美好的精神享受的同時，對于白酒的飲用舒適度有了更高的要求[5]。飲用舒適度作為飲酒后人體最直接的體驗表現(xiàn)，反映了酒品質(zhì)的好壞[6]。越來越多的白酒生產(chǎn)企業(yè)開始關(guān)注飲后感，尤其是酒類消費(fèi)市場已經(jīng)由飲酒到舒適飲酒進(jìn)行深度轉(zhuǎn)變[7]。

飲前及飲中的飲用舒適度的評價主觀性較強(qiáng)，個體差異對兩者影響較大。而對飲后舒適度的評價，因飲用者會產(chǎn)生一系列生理反應(yīng)，評價指標(biāo)相對客觀[8]。造成飲后不適感的原因相當(dāng)復(fù)雜，除了飲酒人的身體狀況、飲用量、飲酒習(xí)慣、思維情緒及環(huán)境因素等以外，還有酒體本身設(shè)計和質(zhì)量的因素，主要包括醛類、醇類物質(zhì)等[9]。目前，雖然對于影響白酒飲用舒適度的確切作用機(jī)制尚不明確，但一般認(rèn)為是多種因素共同作用產(chǎn)生的綜合結(jié)果[10]。近年來，隨著生命科學(xué)研究手段的不斷發(fā)展，越來越多行業(yè)內(nèi)學(xué)者通過建立動物模型評價體系，來直觀評價飲后感[8]。張夢妍等[11]根據(jù)醉酒昏睡期小鼠的醉酒時間、醒酒時間建立了白酒飲用舒適度評價模型。格絨澤仁等[12]通過小鼠曠場實驗結(jié)合高級醇類物質(zhì)定量分析，建立了針對濃香型白酒飲后不適感的關(guān)鍵高級醇類物質(zhì)關(guān)聯(lián)性判定方法。越來越多的研究認(rèn)為酒體特征組分的整體協(xié)調(diào)性對醉度產(chǎn)生較大影響，合適的雜醇、酸、酯比例可有效降低醉度[13]。目前較多研究利用小鼠進(jìn)行白酒相關(guān)試驗，但規(guī)模小，人工操作也較復(fù)雜，成本較高。斑馬魚1994年起被正式確定為一種新型的模式生物，被認(rèn)為是一種適合神經(jīng)化學(xué)和行為研究的脊椎動物，它體型小、繁殖速度快、成本低、易于操作且實驗周期短[14]。目前，斑馬魚已經(jīng)成為最受學(xué)者重視的脊椎動物模式生物之一，在很多學(xué)科上的應(yīng)用也顯示出了很大的潛力[15]。在酒的研究領(lǐng)域中，斑馬魚模型在葡萄酒研究中已被應(yīng)用，錢星文等[16]建立斑馬魚興奮期醉酒模型，評價藥食同源健康產(chǎn)品益甘舒對斑馬魚的解酒作用。國外也有報道通過評估斑馬魚焦慮樣行為、運(yùn)動以及大腦中的氧化損傷，研究N-乙酰半胱氨酸對急性乙醇暴露斑馬魚的影響，以期評估防止酒精宿醉的藥物[17]。但斑馬魚模型尚無在白酒方面的應(yīng)用。

視頻追蹤已經(jīng)成為研究斑馬魚行為的標(biāo)準(zhǔn)流程，通過視頻記錄其運(yùn)動過程，并提取運(yùn)動軌跡和運(yùn)動特征，如速度、路程等，并對這些參數(shù)進(jìn)行分析來進(jìn)行生物學(xué)研究[18]。本研究針對10款市售的4種香型的白酒，通過建立斑馬魚醉酒模型，通過視頻追蹤分析比較斑馬魚暴露于不同白酒1 h和2.5 h后運(yùn)動的行為參數(shù)比。同時結(jié)合白酒高級醇和醛類物質(zhì)的定量分析，建立了引起飲后感差異判定的新方法，確定馥郁香型白酒飲后感快速評價體系。為進(jìn)一步提高酒類品質(zhì)，提高飲用舒適度提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣均選用知名品牌白酒，兩款醬香型白酒A、B，三款濃香型白酒C、D、E，兩款清香型白酒F、G，三款馥郁香型白酒H、I、J，食用酒精（酒精度均為52%vol）：市售；受精后5 d（5 dpf）的野生型AB品系斑馬魚（飼養(yǎng)于杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心（SYXK（浙）2012-0171），養(yǎng)魚用水溫度為28 ℃（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg市售的速溶海鹽，電導(dǎo)率為450～550 μS/cm；pH值為6.5～8.5；硬度為50～100 mg/L CaCO3），飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證，認(rèn)證編號為001458）：杭州環(huán)特生物科技股份有限公司。

仲丁醇、正丙醇、異丁醇、2-戊醇、正丁醇、活性戊醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、乙醛、正丙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、糠醛、苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SZX7解剖顯微鏡：日本OLYMPUS公司；VertA1型CCD相機(jī)：上海土森視覺科技有限公司；V3.11行為分析儀：法國ViewPoint Life Sciences公司；6孔板、96孔板：無錫耐思生命科技股份有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器）（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、CP-WAX57CB色譜柱（50m×0.25mm×0.20μm）：美國Agilent 公司；ME204分析天平（感量為0.1 mg）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

隨機(jī)選取5 dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。實驗組分別水溶給予2%濃度的酒樣A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，對照組1為與酒樣同濃度的優(yōu)級食用酒精，同時設(shè)置對照組2為正常養(yǎng)殖水，每孔容量為3 mL。28 ℃分別處理1 h和2.5 h后，將酒樣移除，隨機(jī)選取10尾斑馬魚利用斑馬魚行為分析儀監(jiān)測斑馬魚的20 min內(nèi)運(yùn)動速度、總運(yùn)動距離和運(yùn)動軌跡，并評價酒樣對斑馬魚運(yùn)動功能的影響。

1.3.2 酒體風(fēng)味成分檢測方法

準(zhǔn)確吸取待測白酒樣品5 mL，加0.1 mL內(nèi)標(biāo)溶液（2%），混勻，經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾后供氣相色譜儀測定[19]。醇、醛類物質(zhì)測定采用氣相色譜法，其色譜條件如下：色譜柱溫度：初溫35 ℃，保持1 min，以3.0 ℃/min升至70 ℃，然后以3.5 ℃/min升至180 ℃，再以15 ℃/min升至210 ℃，保持5～15 min；檢測器溫度250 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氮?dú)猓∟2）（純度99.999 9%），流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比20∶1。采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物選用2%叔戊醇、2%乙酸正戊酯、2%2-乙基丁酸。

1.3.3 行為參數(shù)比的測定

由行為參數(shù)計算行為參數(shù)比，可以減少實驗動物自身原因造成的誤差[20]。若行為參數(shù)比越接近于1，被認(rèn)為酒對行為情緒的影響越小，該研究中行為參數(shù)比以平均速率比表示[21]。

平均速率比=暴露酒樣后斑馬魚運(yùn)動的行為參數(shù)/未暴露酒樣斑馬魚運(yùn)動的行為參數(shù)。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，使用單因素ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示。利用主成分分析法（principal component analysis，PCA）降維的思想，將多個變量轉(zhuǎn)化成為少數(shù)的幾個綜合的變量進(jìn)行分析，并使用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚行為學(xué)實驗結(jié)果

2.1.1 運(yùn)動行為學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果

本研究前期的研究成果表明，斑馬魚對2%的53%vol酒樣的耐受性較好。斑馬魚分別暴露于酒樣1.0 h和2.5 h后轉(zhuǎn)移至正常養(yǎng)殖水觀察1.0 h，發(fā)現(xiàn)在前20 min內(nèi)，各酒樣對其飲后行為的影響最大。因此，本實驗對停止暴露酒樣后20 min內(nèi)的斑馬魚行為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表1。

表1 各處理組斑馬魚運(yùn)動行為學(xué)指標(biāo)Table 1 Behaviors of zebrafish in different treatment group

由表1可知，斑馬魚暴露于酒樣A、B 1.0 h與對照組2有顯著性差異（P＜0.05），而暴露于酒樣A組2.5 h與對照組2間無顯著性差異（P＞0.05），暴露于酒樣B 2.5 h與對照組2有極顯著差異（P＜0.01）。斑馬魚暴露于酒樣C、D、E 1.0 h和2.5 h均與對照組2有極顯著性差異（P＜0.01）。無論斑馬魚暴露酒樣1.0 h或2.5 h，酒樣F組、食用酒精對照組1和正常養(yǎng)殖水對照組2間無顯著性差異（P＞0.05），表明可以消除乙醇對引起飲后不適的關(guān)鍵物質(zhì)的干擾，該結(jié)果與格絨澤仁等[12]的研究結(jié)果相似。而暴露于酒樣酒樣F組2.5 h與對照組間無顯著性差異（P＞0.05）。斑馬魚暴露于酒樣G 1.0 h和2.5 h均與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。其他酒樣H、I、J彼此間無顯著性差異（P＞0.05），但均與對照組有極顯著性差異（P＜0.01）。以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一種香型酒樣具有相似的趨勢，相同品牌下不同品類的酒樣H、I、J差異不大，這可能與生產(chǎn)工藝有關(guān)。

2.1.2 斑馬魚行為參數(shù)比

由行為參數(shù)計算行為參數(shù)比，可以減少實驗動物自身原因造成的誤差[21]。若行為參數(shù)比越接近于1，被認(rèn)為酒對行為情緒的影響越小，斑馬魚飲后行為恢復(fù)正常并與未飲酒斑馬魚感受相當(dāng)，認(rèn)為斑馬魚醒酒，該行為參數(shù)比與1的差值的絕對值為行為偏離度，行為偏離度越小，飲后感的舒適性越高[22]。斑馬魚暴露酒樣不同時間后20 min內(nèi)的平均速率比測定結(jié)果見圖1。

由圖1（a）可知，斑馬魚暴露于酒樣A1.0 h后，平均速率比在前20 min內(nèi)酒樣A組與對照組1有極顯著差異（P＜0.01），第20 min時酒樣A組與對照組1無顯著性差異（P＞0.05），酒樣A組平均速率比接近1，處于醒酒狀態(tài)。15 min時酒樣B組與對照組1無顯著性差異（P＞0.05），酒樣B組斑馬魚醒酒時間超過20 min。斑馬魚暴露于酒樣C、D 和E 1.0 h后，平均速率比顯著低于對照組1（P＜0.01），醒酒時間超過20 min。其中酒樣D組斑馬魚平均速率比顯著低于其他各組（P＜0.01），表明受抑制情況顯著高于其他各組（P＜0.05）。酒樣F組和對照組1在10～20 min時無顯著性差異（P＞0.05），酒樣F組平均速率比在1左右，處于醒酒狀態(tài)。酒樣G組的平均速率比小于1，與對照組1有顯著性差異（P＜0.05），醒酒時間超過20 min。酒樣H、I、J組斑馬魚的平均速率比均小于1且顯著低于對照組1（P＜0.01）。前5 min內(nèi)與酒樣A和B組無顯著性差異（P＞0.05），10～20 min與酒樣C和E組無顯著性差異（P＞0.05），有下降再升高的趨勢，醒酒時間超過20 min。說明暴露于馥郁香型白酒的斑馬魚在醒酒過程前期與暴露于醬香型白酒后的飲后感相當(dāng)，在醒酒過程的后期與暴露于濃香型白酒后的飲后感相當(dāng)。

圖1 暴露酒樣后20 min內(nèi)斑馬魚的平均速率比Fig.1 The average rate ratio of zebrafish within 20 min after exposure of liquor

由圖1（b）可知，斑馬魚暴露于酒樣2.5 h后，前10 min內(nèi)所有酒樣組斑馬魚的平均速率比均低于1，之后有逐漸上升趨勢。在10～20 min內(nèi)，酒樣A和G組斑馬魚平均速率比接近于1，與對照組1差異顯著（P＜0.05）。酒樣F組與對照組1斑馬魚的平均速率比上升至1以上且兩者間無顯著性差異（P＞0.05）。酒樣A、F、G、H、J組與對照組1在20 min時斑馬魚平均速率比接近于1，而酒樣B、C、D、E、I組斑馬魚平均速率比在0.6左右，醒酒時間相對更長。說明隨著暴露酒樣時間延長，馥郁香型白酒H、J與醬香型白酒A和清香型白酒F、G醒酒時間相當(dāng)，酒樣H、J醒酒較快。

2.2 十款白酒高級醇類、醛類物質(zhì)成分的定量分析

高級醇含量不合理是影響酒體醉酒程度的常見原因之一，高級醇含量過高，會抑制神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)，飲酒者次日醒來會出現(xiàn)頭暈、頭痛癥狀[21-23]。此外，過量的醛類物質(zhì)飲后也可造成頭痛，降低飲用舒適度[9]。所以本研究主要以高級醇類、醛類物質(zhì)為研究對象。通過GC-FID檢測A、B、C、D、E、F、H、G、I、J十款白酒的高級醇類及醛類物質(zhì)含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，共檢出13種高級醇類物質(zhì)及7種醛類物質(zhì)。酒樣A、B中高級醇類和醛類物質(zhì)總含量較高，酒樣A中丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、異丁醛、苯甲醛和糠醛含量相對較高。酒樣B中正丙醇、乙醛、正丙醛、乙縮醛含量較高。酒樣D中2-戊醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、異戊醛含量較高。酒樣G中異丁醇、活性戊醇、異戊醇、β-苯乙醇含量較高。酒樣J中仲丁醇含量較高。酒樣E和F高級醇類和醛類物質(zhì)含量均相對較低，酒樣C、H、I、J高級醇類和醛類物質(zhì)含量居中。

2.3 主成分分析結(jié)果

2.3.1 高級醇類物質(zhì)主成分分析

對十款不同香型、品牌的白酒檢測的高級醇類物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，通過主要主成分方差百分比和累積方差貢獻(xiàn)率分析可知，前3個主成分特征根大于0.1，且累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到86.8%，因此選擇前3個成分因子作為主成分因子。由因子負(fù)荷矩陣可知，異丁醇、活性戊醇、異戊醇在主成分1上有較大載荷，正丁醇、正己醇、正戊醇在主成分2上有較大載荷，糠醇在主成分3上有較大載荷。將上述PCA結(jié)果進(jìn)行投影，投影圖見圖2。

圖2 高級醇類物質(zhì)主成分分析投影圖Fig.2 Projection plot of principal component analysis for higher alcohols

由圖2可知，各個酒樣中3個主成分的權(quán)重各不相同，表明不同香型、品牌的酒樣中不同主成分所代表的高級醇類物質(zhì)的貢獻(xiàn)度不同。酒樣A、B和C中主成分3所占權(quán)重最大，表明主成分3所代表的糠醇在其所含的高級醇類物質(zhì)中起主要作用，且在酒樣A中的作用程度大于酒樣B和C。酒樣D、E、J中主成分2所占權(quán)重最大，表明主成分2所代表的正丁醇、正戊醇、正己醇在其所含的高級醇類物質(zhì)中起主要作用，且在酒樣E中的作用程度更顯著。酒樣F和G中主成分1所占權(quán)重最大，表明主成分1所代表的異丁醇、活性戊醇、異戊醇在其所含的高級醇類物質(zhì)中起主要作用。酒樣H和I中3個主成分均不起主要作用。

2.3.2 醛類物質(zhì)主成分分析

以醛類物質(zhì)作為指標(biāo)進(jìn)行分析，通過主要主成分方差百分比和累積方差貢獻(xiàn)率發(fā)現(xiàn)前3個主成分特征根大于0.1，且累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到92.5%，因此選擇前三個成分因子作為主成分因子。由因子負(fù)荷矩陣可知，異戊醛、乙醛在主成分1上有較大載荷，苯甲醛、糠醛在主成分2上有較大載荷，苯甲醛在主成分3上有較大載荷。將上述PCA結(jié)果進(jìn)行投影，投影圖如圖3。

圖3 醛類物質(zhì)主成分分析投影圖Fig.3 Projection plot of principal component analysis for aldehydes

由圖3可知，各個酒樣中3個主成分的權(quán)重各不相同，表明不同香型、品牌的酒樣中不同主成分所代表的醛類物質(zhì)的貢獻(xiàn)度不同。酒樣A、B中主成分2所占權(quán)重最大，表明主成分2所代表的苯甲醛、糠醛在其所含的醛類物質(zhì)中起主要作用。酒樣C、D、G中主成分3所占權(quán)重最大，表明主成分3所代表的苯甲醛在其所含的醛類物質(zhì)中起主要作用。酒樣E、F、H、I、J 中主成分1所占權(quán)重最大，表明主成分1所代表的異戊醛和乙醛在其所含的醛類物質(zhì)中起主要作用，且在酒樣I中的作用程度更大。

從酒樣中高級醇類及醛類物質(zhì)作為指標(biāo)進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，酒樣A、B和C中起主要作用的高級醇是糠醇。酒樣D、E、J中起主要作用的高級醇是正丁醇、正戊醇、正己醇。酒樣F和G中起主要作用的高級醇是異丁醇、活性戊醇、異戊醇。苯甲醛是酒樣A、B、C、D和G中起主要作用的醛類物質(zhì)，此外酒樣A和B中起主要作用的醛類還包括糠醛。酒樣E、F、H、I、J 中起主要作用的醛類是異戊醛和乙醛。

3 討論

本研究結(jié)合斑馬魚行為學(xué)實驗和酒樣高級醇、醛類物質(zhì)主成分分析，對能引起不同香型、品牌白酒飲后不適的關(guān)鍵物質(zhì)進(jìn)行初步判定。研究中通過利用斑馬魚行為學(xué)實驗，根據(jù)飲后20 min內(nèi)的平均行為偏離度發(fā)現(xiàn)，暴露于馥郁香型白酒的斑馬魚在醒酒過程前期與醬香型白酒飲后感相當(dāng)，在醒酒過程的后期與濃香型白酒飲后感相當(dāng)，其中濃香型白酒酒樣D為引起斑馬魚飲后不適感最強(qiáng)的酒樣。從酒樣中高級醇類和醛類物質(zhì)主成分分析結(jié)果來看，酒樣D中起主要作用的高級醇是正丁醇、正戊醇、正己醇，且發(fā)現(xiàn)酒樣D在所有酒樣中這三種物質(zhì)含量最高。結(jié)合行為學(xué)實驗和高級醇物質(zhì)含量檢測結(jié)果，初步推測正丁醇、正戊醇、正己醇為引起酒樣D飲后不適的關(guān)鍵高級醇，三種物質(zhì)的高含量導(dǎo)致了飲后不適感較強(qiáng)。格絨澤仁等[12]進(jìn)行了濃香型白酒不同品牌酒樣中高級醇類物質(zhì)主成分分析，發(fā)現(xiàn)其中以正丁醇、正戊醇、正己醇為關(guān)鍵高級醇的酒樣飲后不適感弱于以異戊醇、異丁醇和2-戊醇為關(guān)鍵高級醇的酒樣，認(rèn)為異戊醇為引起濃香型白酒飲后不適的關(guān)鍵高級醇之一。該結(jié)果與本研究結(jié)果有所不同，推測原因可能是本實驗涉及不同香型、不同品牌的白酒，釀造工藝不盡相同，樣品特征差異范圍較大。

此外，斑馬魚實驗中對比了不同暴露時間下的酒樣飲后感差異，發(fā)現(xiàn)酒樣A在暴露時間從1.0 h延長至2.5 h后，行為偏離度反而減小，飲后舒適度增強(qiáng)。結(jié)合高級醇物質(zhì)和醛類物質(zhì)含量檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酒樣A中正丙醇、丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、苯甲醛和糠醛等部分醇類和醛類物質(zhì)含量相對較高，但是酒樣A整體舒適度卻較高，可能與酸、酯比例有效降低上述物質(zhì)產(chǎn)生的負(fù)影響有關(guān)。由于白酒是一個復(fù)雜的體系，引起飲后不適的關(guān)鍵物質(zhì)可能是綜合作用的結(jié)果，研究涉及的酒樣有限，關(guān)于白酒飲后舒適度未來還需更深入的探究。此外，盡管學(xué)術(shù)界的成熟的視頻追蹤算法在斑馬魚成魚上取得了較好的效果，但由于幼魚的尺寸小、個體特征不明顯、交叉情況嚴(yán)重、運(yùn)動不連續(xù)的特點(diǎn)，市場上商業(yè)的視頻追蹤軟件對幼魚的追蹤效果并不完美，未來需要更深入的研究助力相關(guān)領(lǐng)域的探索[24-25]。

4 結(jié)論

本研究利用斑馬魚試驗對比了不同香型、品牌的白酒飲后舒適度，從平均行為偏離度角度分析，發(fā)現(xiàn)同一香型的酒樣飲后感相似，馥郁香型白酒的飲后舒適度前期與醬香型白酒相近，后期與濃香型白酒相近。隨著暴露酒樣時間延長，暴露于馥郁香型白酒的斑馬魚與暴露于醬香型和清香型白酒斑馬魚的醒酒時間更接近。初步認(rèn)為這與馥郁香型白酒兼具濃、清、醬香三種特征有一定關(guān)系。此外，初步判定正丁醇、正戊醇和正己醇為引起不同香型白酒飲后不適的關(guān)鍵高級醇。本研究為進(jìn)一步深入探究白酒飲后感及其質(zhì)量控制體系奠定基礎(chǔ)。