38例臨床患者留置導(dǎo)尿管的微生物群落多樣性分析

李 丁，陳豪特，楊小琴，王 忠，甘 辛

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 泌尿外科，北京 100091；2.國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究顯示所有到院就醫(yī)的感染類疾病中，泌尿道感染占比較高，感染率高達(dá)20%～30%，并于全年齡段和性別可見，在為患者帶來(lái)嚴(yán)重的軀體癥狀的同時(shí)也極大的增加了疾病治療的經(jīng)濟(jì)成本[1-2]。除社區(qū)感染外，泌尿道感染作為最常見的院內(nèi)感染之一也是僅次于呼吸道感染的第二大院內(nèi)感染，受到世界各國(guó)廣泛關(guān)注[3]。美國(guó)每年僅兒童泌尿道感染的治療就需要醫(yī)保系統(tǒng)投入1.8億美元的費(fèi)用，同時(shí)每年還需要約150萬(wàn)名臨床醫(yī)生參與診治[4]。留置導(dǎo)尿管是臨床解決排尿困難的有效技術(shù)手段，值得注意的是泌尿道感染與醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用導(dǎo)尿管密切相關(guān)，原因包括無(wú)菌操作不當(dāng)、插管過(guò)程中損傷尿道粘膜、留置時(shí)尿道口未消毒或消毒不嚴(yán)格等。留置導(dǎo)尿管為細(xì)菌侵入人體增設(shè)了通道，一旦其表面出現(xiàn)細(xì)菌定植并生成生物膜將進(jìn)一步增加患者感染的風(fēng)險(xiǎn)，報(bào)道顯示我國(guó)因?qū)蚬芤l(fā)的患者泌尿道感染率可達(dá)6.68%～23.5%[5-6]。

本研究以16S rRNA測(cè)序?yàn)槭侄?，該方法通過(guò)PCR擴(kuò)增樣品中16S rRNA片段后對(duì)其中的細(xì)菌進(jìn)行目、屬、種水平的鑒定，具有讀長(zhǎng)高、精度高、通量高以及無(wú)偏性等優(yōu)勢(shì)，作為一種成熟可靠的方法被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定和微生物群落多樣性的研究[7]。相較于微生物傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，該方法不受培養(yǎng)方法的制約，可以更好的發(fā)現(xiàn)樣本中的罕見細(xì)菌、難以培養(yǎng)以及不具有典型特征形態(tài)和生化反應(yīng)的細(xì)菌。通過(guò)檢測(cè)38例北京市西苑醫(yī)院2020年11～12月份間收治的臨床患者短期和長(zhǎng)期留置的導(dǎo)尿管微生物群落構(gòu)成，旨在研究導(dǎo)尿管留置可能給患者造成的感染風(fēng)險(xiǎn)，并為下一步指導(dǎo)臨床干預(yù)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 本研究以北京市中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院泌尿外科2020年11～12月收治的38例導(dǎo)尿管留置患者為對(duì)象開展，并對(duì)患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析。38例患者中，男性31例，女性7例，年齡64～99歲，平均年齡為(82.1±7.2)歲，導(dǎo)尿管平均留置時(shí)間為(25.50±9.66)d。所有入組病例均排除2周內(nèi)抗生素、激素及免疫抑制劑等可能對(duì)細(xì)菌感染存在較大影響的藥物應(yīng)用史。37例患有因前列腺增生或神經(jīng)源性膀胱等造成的尿潴留，占全部病例的97.4%。其中20例留管過(guò)程中有過(guò)抗生素、中藥等在內(nèi)的藥物干預(yù)，占52.6%，其中八寶丹、癃清片、臨床中藥飲片、頭孢西丁、頭孢他啶、哌拉西林鈉他唑巴坦為主要干預(yù)用藥。樣品留置時(shí)間7～41 d，以14、21、28、35 d為分組節(jié)點(diǎn)(見表1)，每組樣品數(shù)分別為S1(6)，S2(5)，S3(7)，S4(15)，S5(5)。導(dǎo)尿管為一次性使用無(wú)菌導(dǎo)尿包-“抗菌超滑行型”(山東百多安醫(yī)療器械有限公司)注冊(cè)證號(hào)：魯食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2660506號(hào)。

表1 38份樣本信息統(tǒng)計(jì)

1.2 樣本采集 取樣前先對(duì)患者尿道口進(jìn)行消毒，戴無(wú)菌手套取出導(dǎo)尿管，用經(jīng)滅菌處理的剪刀截取導(dǎo)尿管留置于患者體內(nèi)部分即尿管自遠(yuǎn)端至水囊部分，放置于(5×5)cm無(wú)菌規(guī)格板上。使用滅菌醫(yī)用棉簽拭子于尿管尖端外周表面不同部位緊貼尿管表面擦拭不少于5次，將拭子尖端折斷并置于含有保存液的滅菌Corning管中保存。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 DNA提取采用Qiagen微生物DNA純化試劑盒(NO:50214)。16s rRNA測(cè)序采用V4+V5特異性引物515FB：5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′，926R:5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′。PCR條件為預(yù)變性95℃，180 s，變性98℃，20 s，退火55℃，15 s，延伸72℃，15 s，循環(huán)25次，終延伸72℃，60 s，反應(yīng)體系為KAPA 熱啟動(dòng)高保真酶(NO:KK2602)50 μL體系。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA無(wú)降解后切膠回收，膠回收條件依照Omega D2500-02膠回收試劑盒。文庫(kù)經(jīng)AglientBioanalyzer和Qubit檢測(cè)定量合格后上機(jī)測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)選擇Hiseq 2500，由北京博奧匯玖生物科技有限公司采用PE250模式進(jìn)行，對(duì)樣本16s rRNA基因 V4-V5區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 序列下機(jī)后經(jīng)skewer軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，并使用FLASH軟件對(duì)paired-end reads進(jìn)行拼接[8-9]。拼接后的序列經(jīng)CD-HIT生成OTU并進(jìn)行OTUs的聚類分析，在OTUs聚類的基礎(chǔ)上使用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋，從而獲得樣本的物種注釋信息及基于物種的豐度分布情況[10-11]。對(duì)OTUs同時(shí)進(jìn)行Alpha多樣性、豐度等在內(nèi)的相關(guān)分析，獲取樣品內(nèi)物種豐富度、均勻度信息和不同樣品間OUTs的共性和特性信息等。此外，對(duì)OTUs進(jìn)行多序列比較構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，基于進(jìn)化樹信息和豐度信息進(jìn)行Beta多樣性分析，獲得不同樣品和分組的群落構(gòu)成差異的信息，以PCA、NMDS和PCoA及距離矩陣熱圖等方式進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取和文庫(kù)構(gòu)建及序列檢測(cè) 樣品經(jīng)提取后DNA總含量經(jīng)Qubit雙鏈試劑盒定量在57～3 850 ng，說(shuō)明不同樣品的微生物總量有較大差異。1%瓊脂糖電泳進(jìn)行快速檢測(cè)，結(jié)果顯示DNA 無(wú)降解。擴(kuò)增后產(chǎn)物使用Qubit進(jìn)行建庫(kù)前DNA 濃度測(cè)定，前一步得到的DNA 濃度的Qubit測(cè)定值最低為3.34 ng/μL，使用55.5 μL 體系建庫(kù)計(jì)算，有0.185 μg 總量，滿足最低0.1 μg 的建庫(kù)需求。文庫(kù)構(gòu)建后經(jīng)AglientBioanalyzer2100進(jìn)行檢測(cè)，其中樣品的主峰長(zhǎng)度574 bp/573 bp/576 bp，除去126 bp 的接頭序列和24 bp 的分子標(biāo)記序列后，剩余期望長(zhǎng)度為424 bp/423 bp/426 bp，與16S rRNA基因V4～V5區(qū)的期望長(zhǎng)度412 bp 接近，考慮到GC 含量等因素的影響以及毛細(xì)管電泳本身的誤差，可以認(rèn)為所擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度與期望值基本相符。

2.2序列檢測(cè) 樣品混合后定量至12pm進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。根據(jù)樣品提取有效測(cè)序，序列中含有特異性擴(kuò)增引物序列，長(zhǎng)度大于可供分析標(biāo)準(zhǔn)的序列稱為有效序列。共獲得1 609 398條序列，其中有效序列1 603 007條，說(shuō)明整體測(cè)序質(zhì)量?jī)?yōu)良。單個(gè)樣品平均總序列42 353條，平均有效序列42 184條，平均有效率達(dá)到99.61%。最少樣品有效序列有35 390條，最多樣品有44 991條，說(shuō)明樣品均一度較好。

本研究樣品的目標(biāo)區(qū)域16S rRNA基因V4～V5區(qū)的平均期望長(zhǎng)度為412 bp。雙端測(cè)序正反向讀取的序列總長(zhǎng)為500 bp，扣除分子標(biāo)記24 bp，共有476 bp。有效序列長(zhǎng)度在382 bp至442 bp之間。測(cè)序所得序列中占比最多的5種長(zhǎng)度及其百分比分別為：412(50.44%)，413(24.46%)，411(8.35%)，414(6.13%)，408(5.59%)，其余長(zhǎng)度占比為5.03%，與期望占比長(zhǎng)度相符。

2.3 OTU序列聚類分析 根據(jù)序列相似性，按97%的相似度，與Silva v132數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將序列歸為多個(gè) OTU(操作分類單元)進(jìn)行分析，共得到11 350個(gè)OTUs和1，668，076個(gè)優(yōu)質(zhì)序列。

2.4 Alpha多樣性分析 當(dāng)序列達(dá)到2 000左右時(shí)香濃曲線進(jìn)入拐點(diǎn)達(dá)到平臺(tái)期(見圖1)，表明本次測(cè)序已經(jīng)覆蓋樣品物種序列，測(cè)序量飽和能夠展現(xiàn)樣本細(xì)菌的多樣性和分布，即使增加深度也不會(huì)對(duì)樣品多樣性產(chǎn)生影響。相較于腸道細(xì)菌、皮膚細(xì)菌、土壤細(xì)菌等自然測(cè)序群體，本實(shí)驗(yàn)樣品多樣性達(dá)到飽和所需序列較少，說(shuō)明導(dǎo)尿管為相對(duì)封閉環(huán)境，微生物群落具有特定性。Rank Abundance曲線在水平方向上有較大跨度，垂直方向也具有分離，說(shuō)明樣本具有多樣性。

圖1 38份樣品香濃曲線

2.5 物種注釋分析 利用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)16s rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)分別在界、門、綱、目、科、屬、種進(jìn)行注釋根據(jù)樣本中包含的各水平物種間的距離進(jìn)行水平物種聚類分析(見圖2)。16s rRNA測(cè)序結(jié)果顯示，以S1-S5時(shí)間段分組，各組樣品中革蘭氏陰性菌所占比例均高于陽(yáng)性菌。在門水平上，各樣品的優(yōu)勢(shì)菌分布隨時(shí)間變化具有規(guī)律性。以28 d為分界點(diǎn)，梭桿菌門(Fusobacteria)豐度上升，28 d以上樣本以35 d為分界可發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)豐度發(fā)生規(guī)律性變化。28 d內(nèi)以14 d為分界點(diǎn)可發(fā)現(xiàn)梭桿菌門隨時(shí)間增長(zhǎng)比例上升，其中14～21 d組合21～28 d組在熱脫球菌(Deinococcus-Thermus)豐度上具有數(shù)值差異。樣本中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)豐度短期(7～14 d)高于中長(zhǎng)期留置患者(見圖3)。其中36個(gè)樣品存在含量>50%的優(yōu)勢(shì)菌門，占全部樣品的86.8%，其中19個(gè)樣品優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，含量63%～100%，占52.8%(19/36)，12個(gè)樣品優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門，含量54%～100%，占33.3%(12/33)，3個(gè)樣品優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門，含量67%～81%，占8.3%(3/36)，2個(gè)樣品優(yōu)勢(shì)菌門為梭桿菌門，含量53%～78%，占5.6%(2/36)。S1-S5各時(shí)間段分組顯示，S1中變形菌門占62.3%，厚壁菌門占33.8%；S2中變形菌門占46.7%，厚壁菌門占36.3%；S3中變形菌門占46.6%，厚壁菌門占34.2%；S4中變形菌門占42.0%，厚壁菌門占34.0%；S5中變形菌門占73.5%，厚壁菌門占16.0%(見圖4)。樣品測(cè)序結(jié)果中包含5種常見的院內(nèi)感染細(xì)菌，其中腸球菌是主要檢出菌，陽(yáng)性率為68.4%，大腸埃希菌陽(yáng)性率為47.4%，銅綠假單胞菌陽(yáng)性率為39.5%，金黃色葡萄球菌陽(yáng)性率為21.1%，肺炎克雷伯菌陽(yáng)性率為2.6%。5個(gè)樣品腸球菌占比>53%，其中3個(gè)樣品腸球菌占比>96.0%，留管時(shí)間除1例為7 d外其余均≥28 d，5例患者中3例患者服用癃清片2例未使用藥物干預(yù)。另有3個(gè)樣品銅綠假單胞菌占比>73.7%，留管時(shí)間≥21 d，其中2例服用頭孢西丁或哌拉西林1例患者未使用藥物干預(yù)。

圖2 導(dǎo)尿管留置時(shí)間與微生物群落聚類分析

圖3 38份樣品中α-變形菌綱分布信息

圖4 38份樣品微生物群落結(jié)構(gòu)

2.6 分組分析 Anosim，PCA，PCoA，NMDS，MRPP和Turkey分析均為檢測(cè)到組間顯著差異。但是針對(duì)各組和菌群的LEfSe檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，組1與孿生球菌屬(Gemella)，擬甲色球藻屬(Chroococcidiopsis)，寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)有較高關(guān)聯(lián)(LDA Score log10>2)，組2與乳球菌屬(Lactococcus)，組5與微單胞菌屬(Parvimonas)有較高關(guān)聯(lián)。

3 討論

導(dǎo)尿管是引發(fā)下尿路感染臨床病例的重要因素之一，病情加重時(shí)還可以誘發(fā)上尿路感染繼而發(fā)生慢性腎功能衰竭、繼發(fā)性高血壓等嚴(yán)重并發(fā)癥，近年來(lái)如何控制導(dǎo)尿管引發(fā)的泌尿系感染已成為臨床關(guān)注的重點(diǎn)。目前尚未見國(guó)內(nèi)外應(yīng)用16s rRNA高通量測(cè)序方法展示患者導(dǎo)尿管表面病原微生物菌群多樣性及分布特點(diǎn)的其他相關(guān)報(bào)道。該方法由于不受培養(yǎng)方法的制約，可以更加深入全面的發(fā)掘患者潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)，為今后指導(dǎo)臨床抗感染治療提供了詳實(shí)可靠的數(shù)據(jù)。

留置尿管是一個(gè)相對(duì)較為封閉的環(huán)境，這在宏基因組研究中是較為特殊的。根據(jù)本研究Alpha多樣性結(jié)果分析顯示，當(dāng)序列條數(shù)達(dá)到2 000左右時(shí)上升曲線便出現(xiàn)拐點(diǎn)并進(jìn)入平臺(tái)期，表明檢測(cè)在較小的通量時(shí)就達(dá)到飽和，這相對(duì)于腸道、土壤等半開放環(huán)境都是差異較大的。本研究探索的檢測(cè)通量也有助于未來(lái)相似研究確定通量范圍、降低檢測(cè)成本、開發(fā)檢測(cè)工具。超高的通量也保證了本研究測(cè)序深度和廣度較為全面的覆蓋了樣本的所有物種，檢測(cè)也比較均勻。

本研究檢測(cè)的38例樣品中包含了包括腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌在內(nèi)的臨床上常見的5種院內(nèi)感染細(xì)菌，其中腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌污染率≥21.1%，表明留置尿管微環(huán)境對(duì)于感染風(fēng)險(xiǎn)有影響。這與陸金金等報(bào)道的2012—2015年尿路感染病原菌主要為大腸埃希菌(37.1%),糞腸球菌(19.9%),銅綠假單胞菌(8.0%),肺炎克雷伯菌(7.5%),白色念珠菌(5.2%)及顏復(fù)生等2009年報(bào)道的647株尿路感染分離株主要為大腸埃希菌(40.8%)、念珠菌屬(28.2%)、腸球菌屬(7.9%)、鏈球菌屬(4.9%)、克雷伯菌屬(3.6%)結(jié)果相似[12-13]。38份樣品中68.4%存在腸球菌，其中3份長(zhǎng)期留置的樣品中該菌占比>96%。腸球菌廣泛分布于自然環(huán)境中，可寄居于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，是引起院內(nèi)感染的重要條件致病菌，能引起尿路感染、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和膿毒血癥等在內(nèi)的多種感染性疾病。其發(fā)病率近年來(lái)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。研究表明，院感腸球菌具有耐藥率高，存在多重耐藥等特點(diǎn)，可能成為耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)，因其固有抗生素耐藥性及其迅速獲得額外抗生素耐藥性的能力使感染很難治療，特別是萬(wàn)古霉素耐藥菌的出現(xiàn)，構(gòu)成了重大的感染控制負(fù)擔(dān)[14-15]。銅綠假單胞菌也是臨床最常見病原菌之一，本研究中39.5%的樣品存在該菌，其中3份長(zhǎng)期留管樣品中含量>73.7%，該菌本身攜帶染色體介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶，可對(duì)氨芐西林、阿莫西林、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢曲松產(chǎn)生天然耐藥，同時(shí)其外排泵機(jī)制可將β-內(nèi)酰胺類、氯霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素類及替加環(huán)素等泵出胞外，從而產(chǎn)生耐藥，該菌多重耐藥發(fā)生率較高[16]。目前大量研究顯示，腸球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌均可以攜帶可傳遞的耐藥質(zhì)粒，一旦發(fā)生質(zhì)粒傳遞導(dǎo)致的多重耐藥將進(jìn)一步加重病人的負(fù)擔(dān)和臨床治療的難度，也對(duì)其他住院病人的健康產(chǎn)生極大威脅[17]。8例單一細(xì)菌占比超過(guò)53%的病例中，5人口服中藥或抗生素藥物干預(yù)，3例未服用任何藥物未見差別(P>0.05)，結(jié)果顯示口服藥物干預(yù)與導(dǎo)尿管菌落構(gòu)成高度單一沒(méi)有相關(guān)性，可能與藥物在取樣位置難以達(dá)到抑菌所需濃度有關(guān)。目前研究也指出生物膜與尿路感染具有密切關(guān)系，細(xì)菌通過(guò)多糖蛋白復(fù)合物將細(xì)菌包裹其中附著在病灶或?qū)Ч鼙砻鎇18]。本研究檢出的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等細(xì)菌均具有形成生物膜的能力，長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管的患者因?yàn)槟虻廊鄙倌蛞侯孪醋饔茫瑢?dǎo)致細(xì)菌容易黏附在導(dǎo)尿管和尿路上皮形成生物膜，而生物膜可以增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性和逃避宿主免疫，常規(guī)消毒劑也難以徹底清除生物膜，從而引發(fā)持續(xù)性的感染。

留置尿管封閉環(huán)境的16s rRNA檢測(cè)顯示出與開放環(huán)境不一樣的規(guī)律。從個(gè)體層面來(lái)看個(gè)體間差異較大，極端個(gè)體較多，在分組層面上，極端個(gè)體的出現(xiàn)使得統(tǒng)計(jì)上分組特征規(guī)律有限。在門水平上，高于85%的樣品出現(xiàn)主導(dǎo)門超過(guò)50%的情況，多個(gè)樣品在屬甚至種水平上優(yōu)勢(shì)菌超過(guò)90%，說(shuō)明這一現(xiàn)象不是偶然的。這表明在無(wú)菌封閉環(huán)境，優(yōu)先定殖菌可獲得巨大的生態(tài)優(yōu)勢(shì)，從而導(dǎo)致極端占比的頻繁出現(xiàn)。優(yōu)勢(shì)定殖菌具有一定的規(guī)律范圍，但就具體菌種的定殖有一定的隨機(jī)性，可能與病人的身體狀況、飲食、用藥具有關(guān)聯(lián)。通過(guò)對(duì)全部樣品的聚類研究發(fā)現(xiàn)，樣品菌群變化規(guī)律總體上與留管時(shí)間相關(guān)。長(zhǎng)留置時(shí)間與高度單一菌群結(jié)構(gòu)有伴隨性出現(xiàn)，同時(shí)某些短期留置含量較低的細(xì)菌隨著時(shí)間逐漸升高，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間單一環(huán)境對(duì)部分菌群具有篩選并易導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，需要進(jìn)一步增加對(duì)尿管留置病人的病例研究，特別是對(duì)需較長(zhǎng)時(shí)間留置尿管病患尿管更換周期的研究應(yīng)納上日程，同時(shí)通過(guò)大量樣本收集和數(shù)據(jù)分析對(duì)留置尿管中的優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)，為尿管留置導(dǎo)致感染的早期治療和針對(duì)性治療提供詳實(shí)可靠的數(shù)據(jù)支持。