基于生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析丹皮酚抗瘢痕疙瘩的作用機(jī)制

劉麗娜， 楊鋒

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院整形外科，湖南省衡陽市 421001)

瘢痕疙瘩(keloid，KD)是創(chuàng)傷后皮膚及皮下組織異常修復(fù)，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞異常增殖，膠原纖維、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積而形成的一種病理性瘢痕，具有侵襲性和復(fù)發(fā)性[1-2]。目前，手術(shù)切除、化學(xué)藥物注射治療、物理治療以及脂肪干細(xì)胞移植等治療手段雖能在一定程度上抑制KD增生，但存在治療周期較長、治療部位局限、不良作用及復(fù)發(fā)率大等缺陷[3]。生物信息學(xué)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析是通過數(shù)據(jù)挖掘、數(shù)據(jù)整合等方式，將疾病與藥物進(jìn)行相互映射，從而獲取核心基因、潛在靶點(diǎn)，為藥物靶點(diǎn)治療帶來了新思路。本研究擬運(yùn)用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的方法對(duì)KD和丹皮酚進(jìn)行整合分析，篩選在KD發(fā)病過程中的核心基因、丹皮酚治療KD的潛在靶標(biāo)蛋白，建立PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?、基因功能注釋，為丹皮酚治療KD提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)資料

KD致病相關(guān)基因來自于CTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫，丹皮酚直接靶點(diǎn)基因來自于TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫。GEO數(shù)據(jù)驗(yàn)證使用的芯片數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫中KD數(shù)據(jù)集，編號(hào)為GSE6820，包含36個(gè)樣本。該數(shù)據(jù)集基于GPL1521平臺(tái)。

1.2 篩選侯選靶點(diǎn)和候選基因

在CTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索并下載KD致病基因。在TCMSP和PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索并下載丹皮酚直接靶點(diǎn)基因，將基因名稱轉(zhuǎn)化為gene symbol形式，合并兩數(shù)據(jù)庫中結(jié)果。將KD致病基因及丹皮酚直接靶點(diǎn)分別輸入到蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(STRING：function protein association networks，STRING，https://cn.string-db.org)中，獲得蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)文件，導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用CytoHubba插件進(jìn)行分析，篩選出KD候選基因和丹皮酚候選靶點(diǎn)。

1.3 藥物-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將KD候選基因和丹皮酚候選靶點(diǎn)均導(dǎo)入STRING中，并使用Cytoscape軟件構(gòu)建疾病-藥物PPI網(wǎng)絡(luò)圖。對(duì)候選靶點(diǎn)及候選基因取交集，獲取潛在藥物靶點(diǎn)，采用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。采用CytoHubba插件分析degree值。

1.4 潛在靶點(diǎn)基因的功能注釋及數(shù)據(jù)可視化

通過DIVAD軟件(database for annotation，visualization and integrated discovery，https://david.ncifcrf.gov/conversion.jsp)進(jìn)行基因功能富集(GO)分析和信號(hào)通路富集(KEGG)分析。運(yùn)用Sangerbox生物信息平臺(tái)進(jìn)行可視化。采用Cytoscape軟件分析GO基因功能、KEGG信號(hào)通路與潛在藥物靶點(diǎn)間的相互作用。

1.5 GEO芯片數(shù)據(jù)集潛在靶點(diǎn)驗(yàn)證

下載GSE6820原始數(shù)據(jù)文件，使用R軟件對(duì)文件進(jìn)行合并及標(biāo)準(zhǔn)化。利用平臺(tái)注釋文件對(duì)探針進(jìn)行注釋，剔除沒有匹配到基因的探針；對(duì)于不同探針映射到同一基因，則選取不同探針均值為最終表達(dá)值。利用limma包計(jì)算基因表達(dá)差異的P值和表達(dá)Fold Change值，選取P<0.05且|log2FC|>1作為篩選指標(biāo)，篩選出KD組織中差異性表達(dá)基因。

2 結(jié) 果

2.1 KD候選基因和丹皮酚候選靶點(diǎn)

CTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫中分別獲得KD致病基因6 271和534個(gè)，取交集獲取KD致病相關(guān)基因312個(gè)。以degree>8(mean degree)為篩選條件，獲取KD候選基因143個(gè)。

TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫中分別獲得丹皮酚相關(guān)基因27和35個(gè)，合并后得到丹皮酚直接靶點(diǎn)基因57個(gè)。以degree>5(mean degree)為篩選條件，獲取KD候選基因29個(gè)。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

構(gòu)建的KD候選基因與丹皮酚候選靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(圖1)包含個(gè)181個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 376條邊。

圖1 KD候選基因與丹皮酚候選靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖圖標(biāo)的顏色越深代表對(duì)應(yīng)基因的degree值越大。

篩選出潛在藥物靶點(diǎn)共11個(gè)，分別是核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制劑(nuclear transcription factor κB inhibitors,NFKBIA)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、磷脂酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶1(protein serine threonine kinase 1,Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB1(nuclear transcription factor-κB1,NF-κB1)、纖維連接蛋白1(fibronectin，F(xiàn)N1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)，CytoHubba插件分析潛在藥物靶點(diǎn)的degree值依次為7、8、3、8、7、10、10、9、7、7、10，并構(gòu)建潛在藥物靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

2.3 潛在藥物靶點(diǎn)的基因注釋及數(shù)據(jù)可視化分析

以P<0.05為條件，篩選出GO基因功能富集條目共37個(gè)、KEGG條目21個(gè)。生物過程(BP)條目21個(gè)，分子功能(MF)條目9個(gè)，細(xì)胞定位(CC)條目7個(gè)。BP主要富集于負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等；MF主要富集于蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及酶結(jié)合等；CC主要富集于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及線粒體等(圖3)。KEGG信號(hào)通路主要富集于磷脂腺肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)、凋亡等信號(hào)通路中(圖3)。潛在藥物靶點(diǎn)與GO功能和KEGG信號(hào)通路之間的相互關(guān)系見圖4。

圖2 潛在藥物靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖圖標(biāo)的顏色越深代表對(duì)應(yīng)潛在藥物靶點(diǎn)的degree值越大。

圖3 潛在藥物靶點(diǎn)基因富集分析圖A為分子功能(MF)氣泡圖；B為細(xì)胞定位(CC)氣泡圖；C為生物過程(BP)的氣泡圖；D為信號(hào)通路氣泡圖。

2.4 作用靶點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果

GSE6820數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異性表達(dá)分析后，發(fā)現(xiàn)該數(shù)據(jù)集僅對(duì)NFKBIA、Bcl-2、TGF-β1、MAPK1、IL-6、NF-κB1、FN1和Caspase-3這8個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，以P<0.05且|log2FC|>1為條件，篩選GSE6820中的差異性表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)NFKBIA、NF-κB1、 TGF-β1符合篩選條件(表1)。

圖4 潛在藥物靶點(diǎn)與GO功能和KEGG信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖PA1～PA21表示信號(hào)通路；MF1～MF9表示分子功能；BP1～BP21表示生物過程；CC1～CC7表示細(xì)胞定位。

表1 作用靶點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

KD在整形外科中是一類難治性的疾病，由于其反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致無法治愈。目前KD的治療方式較多，但治療效果不確切、預(yù)后不佳。丹皮酚是一種來自于牡丹干燥根莖中的中藥單體成分，來源廣泛且提取技術(shù)成熟，在腫瘤治療領(lǐng)域應(yīng)用相當(dāng)廣泛。丹皮酚可以通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、改變腫瘤細(xì)胞生存周期、影響腫瘤細(xì)胞周圍毛細(xì)血管的增殖、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等方式起到抗腫瘤的作用[4]。也有研究表明，丹皮酚可以抑制增生性瘢痕的增長[5]。鑒于KD與腫瘤及增生性瘢痕存在相似性，推測(cè)丹皮酚可以抑制KD成纖維細(xì)胞的過度增殖并促進(jìn)異常增殖成纖維細(xì)胞凋亡。

本文選擇CTD和GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取KD致病基因。CTD數(shù)據(jù)庫可將化學(xué)、基因、表型、疾病和暴露因素的毒理學(xué)信息聯(lián)合起來，包含了KD在內(nèi)的7 200種疾病的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。GeneCards是人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫，也包含有KD致病相關(guān)基因的數(shù)據(jù)信息。選用TCMSP和PubChem數(shù)據(jù)庫獲取丹皮酚直接靶標(biāo)基因。TCMSP數(shù)據(jù)庫包含化學(xué)物質(zhì)、靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，可以獲得中藥成分對(duì)應(yīng)的各種化學(xué)信息等。PubChem是一種化學(xué)模組數(shù)據(jù)庫，包含3個(gè)子數(shù)據(jù)庫，PubChem BioAssay庫用于儲(chǔ)存生化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，PubChem Compound庫用于存儲(chǔ)整理后的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，PubChem SubStance用于儲(chǔ)存機(jī)構(gòu)和個(gè)人上傳的化合物原始數(shù)據(jù)，本研究所需的丹皮酚直接靶點(diǎn)基因來自于PubChem Compound數(shù)據(jù)庫中。靶點(diǎn)驗(yàn)證時(shí)所需的數(shù)據(jù)來自于GEO數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫中包含有腫瘤和非腫瘤數(shù)據(jù)資料，可對(duì)疾病的差異性表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分析。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法篩選出11個(gè)潛在藥物靶點(diǎn)，主要富集于PI3K/Akt信號(hào)通路和凋亡信號(hào)通路。在PI3K/Akt信號(hào)通路中，PI3K接受細(xì)胞膜外的信號(hào)刺激后，可將PIP2磷酸化為PIP3，進(jìn)一步激活A(yù)kt，最終影響下游NF-κB、mTOR及FoXO信號(hào)通路[6-8]。PTEN能逆轉(zhuǎn)PIP2-PIP3的磷酸化過程，降低PI3K/Akt信號(hào)通路的活性[9]。劉琴等[10]發(fā)現(xiàn)，婦科腫瘤疾病中均存在PTEN/PI3K/Akt信號(hào)調(diào)控的異常激活。陳晴晴等[11]發(fā)現(xiàn)PTEN表達(dá)下調(diào)與肝纖維化相關(guān)，通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肝纖維化。許帥等[12]發(fā)現(xiàn)部分中藥可誘導(dǎo)PTEN高表達(dá)而治療糖尿病腎病。綜合分析潛在藥物靶點(diǎn)與凋亡通路直接的相互關(guān)系，丹皮酚調(diào)節(jié)的是凋亡相關(guān)半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依賴性線粒體凋亡相關(guān)通路。丹皮酚主要作用靶點(diǎn)為Bcl-2和Caspase-3。Bcl-2分泌的抑凋亡蛋白Bcl-2主要發(fā)揮穩(wěn)定線粒體膜結(jié)構(gòu)、功能完整性的作用[13]。當(dāng)線粒體膜上Bcl-2的表達(dá)下調(diào)時(shí)，線粒體膜通透性和穩(wěn)定性改變，促進(jìn)Cyt-c的釋放和鈣離子的跨膜流動(dòng)[14]，誘導(dǎo)凋亡復(fù)合體的形成，最終導(dǎo)致Caspase-3參與的細(xì)胞凋亡相關(guān)程序激活[15]。Caspase-3基因編碼的蛋白為Caspase-3，為細(xì)胞凋亡過程的主要執(zhí)行蛋白，通過降解PARP、DFF-45，導(dǎo)致DNA修復(fù)抑制并誘導(dǎo)其碎片化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，凋亡信號(hào)通路常常處于抑制狀態(tài)，Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中IL-6及Bcl-2高表達(dá)，抑制癌細(xì)胞凋亡。

GEO數(shù)據(jù)庫的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，潛在藥物靶點(diǎn)中NFKBIA、NF-κB、TGF-β1在KD成纖維細(xì)胞及正常成纖維細(xì)胞的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要富集于NF-κB信號(hào)通路中。NF-κB信號(hào)通路的激活受多條信號(hào)通路的影響，當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路激活時(shí)，NF-κB信號(hào)通路可被激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及各種蛋白合成；NF-κB還可以受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控，TNF-α受體相關(guān)因子、血管內(nèi)皮生長因子可激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)毛細(xì)血管新生等[16]。

綜上所述，丹皮酚主要作用于NFKBIA、mTOR、Bcl-2、PTEN、TGF-β1、Akt1、MAPK1、IL-6、NF-κB1、FN1、Caspase-3，影響PI3K/Akt信號(hào)通路、Apopotsis信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路來抑制KD的發(fā)生發(fā)展。