基于生物信息學(xué)探討復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)系

秦瑜玲， 隋娟， 侯梓桐， 孟云霄， 周天一， 陳瑞雪

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京市100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京市100029)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指女性與同一性伴侶發(fā)生3次或3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失[1]。RSA病因復(fù)雜，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RSA可能由免疫因素導(dǎo)致[2]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡期女性，近年來(lái)臨床發(fā)現(xiàn)，SLE患者妊娠期間RSA發(fā)病率大大增高，而RSA合并SLE出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)也同樣升高[3]，由此可見(jiàn)兩病之間關(guān)系密切。研究表明，SLE患者妊娠期間會(huì)出現(xiàn)蛻膜絨毛上C3、IgG、IgM等免疫復(fù)合物沉積，影響絨毛的物質(zhì)交換功能，從而導(dǎo)致RSA等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[4]。本文應(yīng)用生物信息學(xué)整合復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的基因信息，從分子層面闡述二者間的相關(guān)作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)與研究思路。

1 資料和方法

1.1 靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)

檢索三大人類疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards、OMIM、Drugbank)，分別以“recurrent spontaneous abortion”“systemic lupus erthymatosus”為關(guān)鍵詞篩選復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)靶點(diǎn)基因。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)所得Relevance Score值的高低與該靶點(diǎn)-疾病聯(lián)系的密切程度呈正相關(guān)，為提高準(zhǔn)確性，僅選擇GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中Score值排名前300的靶點(diǎn)基因。在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)Gene Map高級(jí)搜索中篩選疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因。在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)僅選用經(jīng)食品藥品管理局批準(zhǔn)且為人類基因/蛋白的藥物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。為了提高準(zhǔn)確性，隨后將兩組基因分別通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)轉(zhuǎn)換成Uniprot ID篩選已認(rèn)證靶點(diǎn)同時(shí)合并去重，獲得已明確認(rèn)證的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病靶點(diǎn)基因。

1.2 核心靶點(diǎn)基因篩選

將上述得到的兩組疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因相互映射，然后將交集靶點(diǎn)基因借助String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)(即PPI網(wǎng)絡(luò))，然后導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中，根據(jù)Degree算法計(jì)算出節(jié)點(diǎn)連接度(Degree值)，再于數(shù)據(jù)面板(table panel)中選取Degree值排名前15的靶點(diǎn)制作核心靶點(diǎn)基因圖。這些基因可能用來(lái)解釋復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡之間相互影響的作用機(jī)制。

1.3 生物通路及富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david．ncifcrf．gov/)可用于基因富集分析及信息的可視化，將RSA和SLE疾病靶點(diǎn)基因信息分別導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限定為“Homo sapiens”，分別進(jìn)行KEGG通路分析，按照P值大小選取排名前50的通路，篩選并取兩組的交集，利用Cytoscape軟件構(gòu)建兩種疾病的KEGG交互通路圖。然后再對(duì)兩種疾病進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程(BP)層面的GO分析，根據(jù)P值大小取排名前10，分別繪制富集氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)及核心靶點(diǎn)基因篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)篩選合并去重后，得到復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)有效靶點(diǎn)基因327個(gè)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)有效靶點(diǎn)基因352個(gè)，兩組疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)相互映射，獲得交集靶點(diǎn)基因118個(gè)。將118個(gè)交集靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape3.7.1軟件計(jì)算，得到排名前15的核心交集靶點(diǎn)基因(圖1)，其中STAT3是最核心的交集靶點(diǎn)基因。

圖1 核心靶點(diǎn)基因圖顏色深淺代表Degree值大小，顏色越深，Degree值越大

2.2 生物通路及富集分析結(jié)果

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，RSA和SLE大量通路是重合的，如PI3K-Akt信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路等(圖2)。生物學(xué)過(guò)程(BP)層面GO分析發(fā)現(xiàn)，RSA富集過(guò)程數(shù)量為801個(gè)，SLE富集過(guò)程數(shù)量為404個(gè)，根據(jù)P值大小取排名前10分別繪制生物富集氣泡圖(圖3)。GO分析發(fā)現(xiàn)，RSA和SLE的疾病基因在生物學(xué)過(guò)程(BP)層面都主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路等有關(guān)。

圖2 RSA與SLE的交互通路圖中Signaling pathway已被省略；藍(lán)色代表交互通路，紫色代表復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)通路，紅色代表系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)

3 討 論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因多樣，大多與免疫因素有關(guān)。而系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為育齡期女性常見(jiàn)的免疫系統(tǒng)疾病，以往一般是妊娠的禁忌證，隨著RSA合并SLE的患者數(shù)量不斷增加以及醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，有些患者在SLE控制期可以進(jìn)行妊娠生育，那么，如何更好地改善其妊娠結(jié)局也成為了醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。本文通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)諸多靶點(diǎn)基因及信號(hào)通路與二者相關(guān)，這或許揭示了RSA與SLE之間的相互作用機(jī)制。

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)作為兩病最核心的交集靶點(diǎn)基因，F(xiàn)INAN等[5]研究發(fā)現(xiàn)其rs1053004位點(diǎn)的多態(tài)性改變與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者蛻膜CD4+T細(xì)胞的STAT3磷酸化水平明顯高于正常孕婦，說(shuō)明RSA患者母胎界面T細(xì)胞中的STAT3是被過(guò)度激活，而這種過(guò)度磷酸化會(huì)影響妊娠結(jié)局，造成反復(fù)自然流產(chǎn)。有研究表明系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生與Th17/Treg平衡失調(diào)密切相關(guān)，而Th17細(xì)胞分化、增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)也是STAT3，Th17分化增強(qiáng)會(huì)加速SLE的進(jìn)展。

白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、IL-4、IL-1β、IL-2、IL-13等都參與免疫反應(yīng)，正常妊娠需要母體免疫系統(tǒng)對(duì)母胎抗原產(chǎn)生免疫識(shí)別和免疫耐受，這能避免不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。而白細(xì)胞介素可以誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的產(chǎn)生，早有研究表明高表達(dá)的TNF-α?xí)蚱颇柑ソ缑鎀h1/Th2免疫平衡，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子水平升高，產(chǎn)生排斥胚胎的細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而引起流產(chǎn)[7-8]。研究同樣發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細(xì)胞也參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)生機(jī)制[9]。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是VEGF主要的形式，有證據(jù)表明VEGF在胎兒和胎盤血管生成中影響很大，RSA病例胎盤樣本中早期滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF表達(dá)較胎齡匹配的正常胎盤弱[10]，Xu等[11]Meta分析顯示VEGF基因rs1570360、rs3025039等的多態(tài)性與RSA風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)。Wei等[12]分析則表明VEGF基因多態(tài)性與慢性免疫介導(dǎo)炎性疾病易感性密切相關(guān)，而SLE就包含其中。

JAK/STAT信號(hào)通路是RSA與SLE的交互通路之一，其中，JAK2是JAK基因家族的一員，其對(duì)IL-12信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用，從而影響T細(xì)胞的分化，同時(shí)，JAK/STAT蛋白可以抑制多種細(xì)胞因子，細(xì)胞因子的失調(diào)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的一個(gè)標(biāo)志[13]。同樣，JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)責(zé)介導(dǎo)50多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的信號(hào)，如干擾素(IFN)Ⅰ型(α/β)和Ⅱ型(γ)已經(jīng)在SLE病理生理學(xué)中得到證實(shí)[14]。基因富集的通路分析也表明RSA的發(fā)生與細(xì)胞因子、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用等細(xì)胞信號(hào)通路密切相關(guān)，JAK/STAT通路是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的主要信號(hào)機(jī)制，受到IL-6細(xì)胞因子的主要調(diào)節(jié)。比如文獻(xiàn)[15]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)沉默或敲低JAK或STAT的RNA可阻斷IL-6的生物學(xué)效應(yīng)。

PI3K/Akt通路由磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)及Akt組成，主要是調(diào)控細(xì)胞增殖和分化[16]。梁衛(wèi)桃[17]研究發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)患者可能是PI3K/Akt通路被抑制，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，分泌的β-HCG和孕酮減少，繼而導(dǎo)致流產(chǎn)。研究還顯示PI3K/Akt通路在血管形成過(guò)程中起到重要作用[18]，夏妍芬等[19]發(fā)現(xiàn)使用PI3K抑制劑LY294002可以逆轉(zhuǎn)低氧對(duì)VEGF的上調(diào)表達(dá)作用，得出阻斷PI3K/Akt通路可以減少VEGF合成的結(jié)論。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)研究分別篩選得到了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡致病相關(guān)的靶點(diǎn)基因、核心交集靶點(diǎn)基因與生物富集信號(hào)通路，同時(shí)用可視化圖表清晰地表示出二者的相互作用關(guān)系，既從分子機(jī)制為探索兩種疾病的聯(lián)系提供了參考，同時(shí)也給臨床發(fā)掘疾病診斷標(biāo)志物及藥物治療提供了新思路。當(dāng)然，本研究均是基于數(shù)據(jù)庫(kù)信息，仍需要進(jìn)一步完善相關(guān)臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。