槲皮素對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)功能的影響

梁文輝， 華翠輝， 唐燕玲

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東省廣州市510405)

桑寄生是傳統(tǒng)的中藥材，具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性[1-2]。槲皮素是桑寄生的主要活性成分，其藥理作用廣泛。有研究顯示，槲皮素可減少創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應(yīng)所致的腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡[3]，可改善實(shí)驗(yàn)性腦積水從而減輕神經(jīng)損傷[4]。腦梗死是腦血管疾病中最為常見(jiàn)的類型，嚴(yán)重影響患者生命健康和生活質(zhì)量，對(duì)腦梗死進(jìn)行預(yù)防性治療有重要的臨床意義。槲皮素對(duì)腦梗死的保護(hù)作用研究尚處于起步階段，本研究建立腦梗死大鼠模型，觀察槲皮素對(duì)腦梗死大鼠模型神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)功能、凋亡相關(guān)蛋白、生長(zhǎng)因子及Toll樣受體/核因子κB(Toll-like receptor-4/nuclear factor-κB，TLR4/NF-κB)炎癥信號(hào)通路的影響，探究其可能存在的機(jī)制，為臨床提供參考。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

6～8周齡SD大鼠60只，雄性，SPF級(jí)別，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2020-0005。將大鼠于22～25 ℃恒溫、相對(duì)濕度45%～55%、晝夜12 h交替條件下，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

槲皮素(南京曼格斯生物科技有限公司，純度>98%，批號(hào)20190520)；氯化三苯基四氮唑(TTC)染液、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)(美國(guó)Singma公司)；末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase/(TdT-)mediated nick end labeling，TUNEL)試劑盒(美國(guó)Chemicon公司)；酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；抗Caspase-3、Caspase-9、TLR4、NF-κB、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)及β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；生物光學(xué)顯微鏡(BX50型，日本Olympus公司)；凝膠電泳儀和電轉(zhuǎn)儀(DYCZ-24DH型，DYY-7C型，北京六一生物科技有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建

將60只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、模型組、槲皮素低、中、高劑量組。采用改良Longa法[5]構(gòu)建腦梗死大鼠模型，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，缺血2 h后恢復(fù)灌注24 h。假手術(shù)組分離上述動(dòng)脈但不結(jié)扎。大鼠清醒后，表現(xiàn)出手術(shù)對(duì)側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，提示腦梗死大鼠模型構(gòu)建成功。于術(shù)前14天，槲皮素低、中、高劑量組分別給予25、50、100 mg/kg槲皮素灌胃處理[6]，1次/天，連續(xù)14天；假手術(shù)組和模型組灌胃以生理鹽水替代。腦缺血再灌注24 h后，觀察神經(jīng)功能行為，再麻醉處死剖取腦組織，部分腦組織制備石蠟切片，剩余部分置于液氮中凍存待測(cè)。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

將大鼠置于地面，觀察肢體活動(dòng)情況，參照Longa法[7]進(jìn)行各組神經(jīng)功能缺失評(píng)分。正常活動(dòng)、無(wú)癥狀為0分，左前肢無(wú)法完全展開(kāi)為1分，向左側(cè)推動(dòng)時(shí)爬行阻力下降為2分，爬行時(shí)向左側(cè)翻轉(zhuǎn)為3分，喪失意識(shí)、無(wú)法行走為4分。

1.4 腦組織病理觀察

將腦組織固定于4%多聚甲醛中過(guò)夜，制備4 μm石蠟切片，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腦組織病理變化。將腦組織從額極縱切5個(gè)冠狀腦片，置于TTC染液中，37 ℃染色20 min，再固定于4%多聚甲醛中過(guò)夜，拍攝照片，并用軟件HPIAS-1000計(jì)算腦梗死體積(梗死體積/總體積×100%)。

1.5 TUNEL染色

將腦組織固定于4%多聚甲醛中過(guò)夜，制備4 μm石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水，添加蛋白酶K修復(fù)抗原，參照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，再添加DAB顯色，光鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色染色的陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法

取缺血側(cè)腦組織以1∶9混入生理鹽水，冰上勻漿，12 000 r/min 離心10 min分離上清液，參照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)腦組織勻漿液中IL-6、IL-1β、TNF-α、BDNF、VEGF及HGF含量。

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

取適量腦組織，加入RIPA裂解液充分裂解提取總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒定量后，混入5×上樣緩沖液水浴變性，取50 μg變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜，浸于5%脫脂牛奶室溫下孵育2 h，分別加入Caspase-3、Caspase-9、TLR4、NF-κB、p-NF-κB及β-actin蛋白一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(鼠)二抗(1∶5 000)，最后添加化學(xué)試劑發(fā)光顯影。以β-actin為內(nèi)參表示Caspase-3、Caspase-9、TLR4蛋白的相對(duì)表達(dá)量，p-NF-κB灰度值與NF-κB灰度值比值表示NF-κB磷酸化水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)行為學(xué)和病理觀察的比較

HE染色顯示，假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊有序；模型組腦組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞核固縮，有明顯水腫；不同劑量槲皮素組均有不同程度病理改變，仍可見(jiàn)細(xì)胞水腫、細(xì)胞排列欠整齊，其中高劑量組上述病理改變較模型組明顯減輕(圖1)。與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積升高(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積降低(P<0.05；表1)。

圖1 槲皮素對(duì)腦梗死大鼠腦梗死體積和腦組織病理?yè)p傷(HE染色， 400×)的影響A為假手術(shù)組；B為模型組；C為槲皮素低劑量組；D為槲皮素中劑量組；E為槲皮素高劑量組。

表1 槲皮素對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積的影響(n=12)

2.2 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況的比較

與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組細(xì)胞凋亡率、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)均降低(P<0.05；圖2和表2)。

圖2 槲皮素對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A為假手術(shù)組；B為模型組；C為槲皮素低劑量組；D為槲皮素中劑量組；E為槲皮素高劑量組。

表2 槲皮素對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響(n=6)

2.3 各組腦組織生長(zhǎng)因子水平的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織BDNF、VEGF水平升高，HGF水平降低(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組BDNF、VEGF及HGF水平升高(P<0.05；表3)。

表3 槲皮素對(duì)腦梗死大鼠腦組織生長(zhǎng)因子水平的影響(n=6)

2.4 各組腦組織炎癥因子水平的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織IL-6、IL-1β及TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組IL-6、IL-1β及TNF-α水平降低(P<0.05；表4)。

表4 槲皮素對(duì)腦梗死大鼠腦組織炎癥因子水平的影響(n=6) 單位：ng/L

2.5 各組TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中TLR4、p-NF-κB/NF-κB水平升高(P<0.05)；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組TLR4、p-NF-κB/NF-κB水平降低(P<0.05；圖3)。

圖3 槲皮素對(duì)腦梗死大鼠腦組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響1為假手術(shù)組；2為模型組；3為槲皮素低劑量組；4為槲皮素中劑量組；5為槲皮素高劑量組。a為P<0.05，與假手術(shù)組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

腦梗死的發(fā)病機(jī)制十分繁雜，高血壓、糖尿病、吸煙、遺傳因素等都是其常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素[8]。腦梗死在中醫(yī)中屬于“中風(fēng)病”的范疇，而桑寄生常與其他中藥材配伍，用于腦梗死的臨床治療[9]。槲皮素作為桑寄生的主要有效成分，其在腦梗死中的應(yīng)用也有相關(guān)報(bào)道。楊冉等[10]研究結(jié)果顯示，槲皮素可保護(hù)腦缺血再灌注大鼠血腦屏障，并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。Park等[11]通過(guò)大腦中動(dòng)脈閉塞法誘導(dǎo)局灶性腦缺血大鼠模型，發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但槲皮素在腦梗死大鼠中預(yù)處理效果的報(bào)道較少。

本研究采用穩(wěn)定性、可重復(fù)性較高的線栓法制備大鼠腦梗死模型，結(jié)果顯示，槲皮素預(yù)處理可明顯減輕腦組織病理?yè)p傷，減少腦梗死體積，并改善神經(jīng)功能，這與文獻(xiàn)[12]顯示槲皮素對(duì)腦組織的保護(hù)作用基本相符。細(xì)胞生長(zhǎng)因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和分化中起關(guān)鍵作用，其中BDNF、VEGF及HGF均是具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)重塑作用的神經(jīng)生長(zhǎng)因子[13]。本研究中，槲皮素預(yù)處理后，大鼠腦組織中BDNF、VEGF及HGF水平明顯上升，提示槲皮素預(yù)處理可促進(jìn)上述神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

目前有研究認(rèn)為，盡早恢復(fù)缺血區(qū)域的血氧供應(yīng)及減少腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是治療腦梗死的關(guān)鍵手段[14]。腦組織缺血可刺激細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[15]。進(jìn)一步探究槲皮素預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，槲皮素預(yù)處理后TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)也下調(diào)，表明槲皮素預(yù)處理可通過(guò)降低Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，抑制腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；這與Taylor等[16]研究顯示槲皮素的抗凋亡作用相符。同時(shí)，炎癥反應(yīng)也貫穿腦梗死整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程，TLR4是炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑的起始因子，在受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位，其與接頭蛋白髓樣分化因子結(jié)合，可激活NF-κB進(jìn)一步刺激炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α等的分泌，導(dǎo)致組織炎癥免疫的過(guò)度表達(dá)[17]。Wu等[18]研究顯示，槲皮素可抑制TLR4/NF-κB通路，減輕新生兒缺氧引起的腦損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理槲皮素后大鼠腦組織IL-6、IL-1β及TNF-α水平下降，TLR4及NF-κB磷酸化水平也降低，表明槲皮素可能通過(guò)阻滯TLR4/NF-κB通路，降低腦組織內(nèi)炎癥反應(yīng)。另外，不同劑量槲皮素預(yù)處理腦梗死大鼠，50、100 mg/kg劑量時(shí)上述改變顯著，但25 mg/kg槲皮素對(duì)腦梗死大鼠無(wú)明顯影響，提示槲皮素的臨床應(yīng)用中還需要考慮其用藥劑量，以達(dá)到最佳效果。

綜上所述，預(yù)處理槲皮素可有效保護(hù)腦梗死大鼠，主要通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減輕神經(jīng)功能損傷、阻滯TLR4/NF-κB通路降低炎癥反應(yīng)。