不同砧木對歐亞種葡萄‘丹娜’果實類黃酮物質(zhì)的影響

韓曉，楊航宇，陳為凱，王軍，何非

不同砧木對歐亞種葡萄‘丹娜’果實類黃酮物質(zhì)的影響

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院葡萄與葡萄酒研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實驗室，北京 100083

【目的】類黃酮物質(zhì)是釀酒葡萄的重要代謝產(chǎn)物，對葡萄果實及其葡萄酒的品質(zhì)有重要影響。研究不同砧木對‘丹娜’（L. cv. Tannat）葡萄基本理化指標(biāo)和類黃酮物質(zhì)的影響，為砧木的選擇利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳浴つ取咸研律覟榻铀?，綠枝嫁接‘1103P’‘101-14’‘SO4’和‘貝達(dá)’（‘Beta’）等4種不同砧木，在分析不同嫁接苗商業(yè)采收期（2016、2017和2019年）葡萄果實基本理化指標(biāo)（可溶性固形物、可滴定酸、pH、百粒重）的基礎(chǔ)上，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)，檢測‘丹娜’葡萄不同砧穗組合和自根苗的類黃酮物質(zhì)組成和含量?！窘Y(jié)果】砧木對‘丹娜’葡萄果實百粒重影響較小，自根苗和‘101-14’嫁接的‘丹娜’葡萄可溶性固形物較高；Tannat/1103P、Tannat/101-14和Tannat/Beta組合果汁可滴定酸濃度高于自根苗；Tannat/SO4組合的花色苷和黃酮醇含量最低，Tannat/101-14組合與自根苗花色苷和黃酮醇含量較高；Tannat/101-14組合果皮中的黃烷醇含量較高，Tannat/1103P組合果皮中花色苷、黃酮醇含量較低，但黃烷醇含量較高。通過OPLS-DA模型，發(fā)現(xiàn)與自根苗相比，Tannat/101-14組合差異化合物主要是二甲花翠素類花色苷；Tannat/Beta組合主要差異化合物為二甲花翠素類、花翠素類和乙?；惢ㄉ铡㈤纹に仡慄S酮醇以及總黃烷醇；而Tannat/SO4組合與自根苗差異化合物二甲花翠素類、花翠素類、花青素類和乙?；惢ㄉ占伴纹に仡慄S酮醇；Tannat/1103P組合的差異化合物則主要為乙?；惡投谆ù渌仡惢ㄉ?、槲皮素類黃酮醇?！窘Y(jié)論】在北京地區(qū)，4種砧木嫁接都有降低‘丹娜’葡萄果實中甲基花青素類、甲基花翠素類、花青素類、非?；?、乙酰化類、香豆?；惢ㄉ找约懊吠惡臀鞑麃喡淙~松黃酮類黃酮醇物質(zhì)的趨勢。‘101-14’嫁接的‘丹娜’葡萄果皮中花色苷、黃酮醇、黃烷醇等類黃酮物質(zhì)積累較多，有利于釀酒品質(zhì)的提升，推薦使用；而‘SO4’嫁接的‘丹娜’葡萄類黃酮物質(zhì)積累較少，不推薦使用。

釀酒葡萄；‘丹娜’葡萄；砧木；類黃酮；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）

0 引言

【研究意義】類黃酮物質(zhì)是釀酒葡萄果實中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，對葡萄酒的色澤和口感有很大影響，可以賦予葡萄果實及其釀造的葡萄酒以獨(dú)特的品質(zhì)，多年來備受關(guān)注[1-4]。葡萄果實中的類黃酮物質(zhì)主要包含花色苷、黃酮醇和黃烷醇3大類，主要在釀酒葡萄的果皮和種子（黃烷醇）中積累[5-7]。影響釀酒葡萄類黃酮物質(zhì)積累的因素多種多樣，如葡萄品種、光照、溫度、土壤環(huán)境、水分條件和栽培方式等。研究不同砧木對接穗葡萄果實類黃酮物質(zhì)的影響，有助于明確不同砧穗組合間類黃酮代謝物的差異，為葡萄酒定向釀造提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】嫁接是葡萄栽培中廣泛應(yīng)用的一種農(nóng)藝措施，至今已有2 500多年的歷史。葡萄砧木的研究與利用始于根瘤蚜傳入歐洲并帶來毀滅性災(zāi)害[8-9]，因為原產(chǎn)于北美的葡萄種對葡萄根瘤蚜具有抗性[10]。此外，不同基因型的砧木對因土壤因素引起的其他生物和非生物脅迫也表現(xiàn)不同的耐性/抗性[11]，因此，在葡萄栽培上，大量采用嫁接苗代替自根苗。不同砧木對接穗品種的生長發(fā)育、光合速率、果實和葡萄酒品質(zhì)產(chǎn)生影響[12-18]，研究發(fā)現(xiàn)，砧木通過影響接穗果實的可溶性固形物濃度（°Brix）、pH、多酚等成分含量，從而影響葡萄酒質(zhì)量[19]。眾多研究表明，砧木對接穗品種植物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀、生理代謝、基因表達(dá)均有不同程度的影響[20-26]。不同砧木由于自身遺傳特性的不同，對接穗品種類黃酮物質(zhì)的積累也產(chǎn)生不同的影響。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，砧木‘Ganzin 1’抑制‘赤霞珠’葡萄果皮黃烷-3-醇的積累；‘101-14’‘5A’‘5BB’‘Ganzin 1’‘Harmony’‘Riparia Gloire’和‘SO4’降低了‘赤霞珠’葡萄果實中表兒茶素的濃度和比例；‘5A’‘Harmony’和‘Riparia Gloire’提高了‘赤霞珠’葡萄果皮黃酮醇的濃度；‘SO4’降低了大部分單體花色苷的濃度。另有研究表明，嫁接到‘SO4’砧木上的‘美樂’葡萄與嫁接其他砧木的‘美樂’葡萄相比，其果皮和種子中的花色苷濃度較高，而嫁接到砧木‘Gravesac’上的‘美樂’葡萄果皮和種子中花色苷濃度顯著偏低[28]。嫁接到‘Chasselas 41B’砧木上的‘Vranec’葡萄果實中花色苷含量較高，嫁接到‘Rupestris Du Lot’砧木的‘Vranec’葡萄果實中黃酮醇含量較高；嫁接到‘Fercal’砧木上的‘Vranec’葡萄果實中顯示較高水平的黃烷醇[29]。但HARBERTSON等[30]研究了‘霞多麗’‘美樂’和‘西拉’分別嫁接到5種砧木（‘5C’‘140R’‘113P’‘3309C’和‘101CU’），并與各自的自根植株相比，發(fā)現(xiàn)各個砧穗組合中花色苷含量并沒有顯著性差異。由此可見，不同砧木對接穗品種果實類黃酮物質(zhì)含量的影響不同。目前關(guān)于砧木對葡萄果實品質(zhì)的研究多集中在糖、酸、pH等基本指標(biāo)上，關(guān)于砧木對類黃酮物質(zhì)的研究相對較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】‘丹娜’作為優(yōu)良的釀酒品種，以擁有高品質(zhì)及高含量的單寧而聞名，陳釀潛力大，廣泛種植于法國、智利、阿根廷和烏拉圭等地，近年來在我國也開始推廣種植。目前關(guān)于‘丹娜’葡萄酒類黃酮物質(zhì)的報道較多，但是關(guān)于‘丹娜’葡萄果實類黃酮物質(zhì)，尤其是不同砧木嫁接‘丹娜’葡萄果實中類黃酮物質(zhì)的研究尚未有報道，不同砧穗組合之間的特征性類黃酮化合物也尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以不同砧木嫁接‘丹娜’葡萄，在分析商業(yè)采收期葡萄果實基本理化指標(biāo)的基礎(chǔ)上，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，研究不同砧木對‘丹娜’類黃酮化合物積累的影響，以明確不同砧穗組合與自根苗之間的差異化合物，旨在為釀酒葡萄實際生產(chǎn)中砧木的選擇應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 試驗地點(diǎn)位于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站，試驗地為平地，土壤類型為砂質(zhì)黏壤土?！甌annat’所嫁接的砧木分別為‘1103P’‘101-14’ ‘SO4’和‘Beta’，以‘Tannat’自根苗作為對照；各砧木定植于2012年，于2013年夏季進(jìn)行綠枝嫁接。2016、2017、2019三個年份測定不同砧穗組合中花色苷、黃酮醇、黃烷醇的含量（2018年由于試驗地氣候原因，病害嚴(yán)重，在采收期并未采收到健康成熟的果實，2019年采收期采到自根苗及‘1103P’‘101-14’‘Beta’嫁接的‘Tannat’果實，未采到Tanant/SO4組合果實）。于果實成熟期進(jìn)行采樣，2016年采樣日期為9月23日，2017年采樣日期為9月15日，2019年采樣日期為9月17日。葡萄各砧穗組合種植均為南北行向，行距和株距分別為2.5 m和1.2 m，南北行向，籬架，樹形為傾斜式單龍干，葉幕形為改良型VSP（M-VSP，即“廠”字形），采用短枝修剪，葉幕高度和寬度分別保持在約120 cm和70 cm，留梢量為12—15新梢/延長米，灌溉方式為滴灌，采用常規(guī)葡萄園管理，灌溉、施肥和病蟲害控制等均按照相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2016、2017、2019等3年的氣象資料來源于中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)（http://data.cma.cn/），觀測點(diǎn)（40°23 N，116°52′ E）與試驗地直線距離約30 km。以“百粒果”的方法采收每個砧穗組合成熟期的葡萄果實樣品，每種樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。樣品采集后迅速用液氮速凍，液氮保護(hù)下轉(zhuǎn)運(yùn)至實驗室后置于-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 乙酸鈉（分析純）、甲醇（分析純）、丙酮（分析純），北京化工廠；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純），F(xiàn)isher公司（Hampton，USA）；類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，包括二甲花翠素-3--葡萄糖苷、兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和槲皮素-3--葡萄糖苷，Sigma公司（St. Louis，MO，USA）。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1C-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Micro 17R離心機(jī)，賽默飛世爾公司；Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器（DAD）的LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；Agilent 1200系列LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；Agilent 1200系列配有可變波長檢測器（VWD）的高效液相色譜串聯(lián)Bruker系列離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 果實理化指標(biāo)的檢測 電子天平（精度0.01 g）稱量100粒果實重，共設(shè)3組平行。隨機(jī)選取50粒無物理性損傷、無病蟲害、發(fā)育正常的葡萄果實，充分?jǐn)D壓出汁后，利用手持糖度計測定葡萄汁的可溶性固形物含量，采用pH計測定葡萄汁的pH?？傻味ㄋ岬臏y定參照國標(biāo)GB12293—1990進(jìn)行測定。

1.3.2 葡萄果皮花色苷和黃酮醇的提取與測定 利用50%（v/v）甲醇水溶液對花色苷和黃酮醇進(jìn)行低溫避光提取，具體方法參考參照 Downey等[31]、胡麗等[32]?；ㄉ諟y定：使用Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器（DAD）的LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為Kromasil100-5-C18（250 mm×4.6 mm），柱溫50℃，進(jìn)樣量30 μL，檢測波長為525 nm，流速為1 mL?min-1，離子阱質(zhì)譜檢測器的采集參數(shù)為電噴霧離子源，正離子模式，離子掃描范圍為100—1 500 m/z，霧化器壓力為30 psi，干燥器流速為10 L?min-1，干燥氣溫度為325℃，具體測定檢測條件參照胡麗等[32]。黃酮醇測定：使用Agilent 1200系列配有可變波長檢測器（VWD）的LC-UV高效液相色譜串聯(lián)Bruker系列的離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為ZorbaxEclipseXDB-C18（250 mm×4.6 mm）。具體測定檢測條件參照胡麗等[32]。

1.3.3 葡萄果皮和種子中黃烷醇的提取與測定 利用70%（v/v）丙酮水溶液提取游離黃烷醇，并進(jìn)行氮吹濃縮，鹽酸甲醇溶液復(fù)溶。用間苯三酚裂解果皮中黃烷醇，具體方法參照胡麗等[32]。黃烷醇測定：使用Agilent 1200系列HPLC-MS/MS高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，色譜柱為Poroshell 120 EC-C18 column（150 mm×2.1 mm，2.7 μm），具體測定方法和檢測條件參照胡麗等[32]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差計算等均通過Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行分析；采用SPSS 22.0（IBM，USA）統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和雙因素方差分析，采用Orgin pro 2021進(jìn)行氣象圖繪制，采用SMICA14.1進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析。

2 結(jié)果

2.1 葡萄園氣象條件

如圖1所示，通過對葡萄園所在地區(qū)2016、2017、2019年3年葡萄生長季氣象數(shù)據(jù)的搜集、整理與分析，發(fā)現(xiàn)2017年總光照時數(shù)最大，2019年次之，2016年最小。且2016年降雨量最大，總有效積溫較低，特別是2016年葡萄轉(zhuǎn)色前降雨量較大。2017年降雨集中在7月初和8月初，葡萄收獲前期降雨量較小。2019年總降雨量最小，生長前期（5—7月）降雨較小，采收前有少量降雨。

圖1 氣象數(shù)據(jù)

Fig. 1 Meteorological data

2.2 不同砧木對‘丹娜’葡萄果實基本理化指標(biāo)的影響

在果實百粒重方面，2016年各砧穗組合及自根苗之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異；2017年，Tannat/Beta組合的果實百粒重小于自根苗，其余砧穗組合與自根苗之間沒有顯著差異；2019年，Tannat/101-14與‘Tanant’自根苗無顯著差異，兩者顯著高于Tannat/1103P和Tannat/Beta組合。在可溶性固形物方面，2016年的Tannat/101-14和Tannat/Beta與自根苗無顯著性差異，Tannat/1103P和Tannat/SO4均低于自根苗；2017年Tannat/101-14顯著高于自根苗及其他砧穗組合；2019年，Tannat/101-14和自根苗顯著高于Tannat/ 1103P和Tannat/Beta組合。對于果汁pH，2016年所有砧穗組合與自根苗相比沒有顯著性差異；2017年，Tannat/101-14組合pH最高，Tannat/Beta最低；2019年，Tannat/1103P組合最高，同樣以Tannat/Beta組合果汁pH最低。對于可滴定酸，2016年所有砧穗組合無顯著差異；2017年自根苗可滴定酸顯著低于Tannat/1103P、Tannat/101-14、Tannat/Beta；2019年，自根苗可滴定酸顯著低于Tannat/101-14、Tannat/Beta組合（表1）。

表1 不同砧穗組合‘丹娜’葡萄果實的基本理化指標(biāo)

Tannat簡寫為T，不同小寫字母表示同一年份不同處理間差異達(dá)到顯著性水平（Duncan’s test，＜0.05），NA表示缺失值。下同

Tannat is short for T, Different lowercase letters indicate significant differences between treatments in the same year (Duncan’s test,＜0.05), NA represents the missing value. The same as blow

2.3 砧木對‘丹娜’葡萄花色苷含量的影響

在‘丹娜’葡萄果皮中共檢測到16種單體花色苷，且各個砧穗組合中所含花色苷種類相同，主要包括5種非?；ㄉ?，5種乙?；ㄉ眨?種香豆?；ㄉ蘸?種咖啡酰化花色苷。由表2可知，3年的試驗均表明，自根苗葡萄果皮中總花色苷含量最高，嫁接苗都有降低花色苷總含量的趨勢，且2016—2017連續(xù)2年的試驗表明，Tannat/SO4組合花色苷含量最低。對于不同種類的花色苷，2016年，自根苗和Tannat/Beta組合中甲基花青素和二甲花翠素類花色苷含量顯著高于Tannat/SO4組合。2017年，自根苗和Tannat/101-14組合花青素、花翠素、甲基花青素和甲基花翠素類花色苷含量均顯著高于其他組合（＜0.05）；而對于二甲花翠素類花色苷，自根苗和Tannat/101-14顯著高于Tannat/1103P、Tannat/Beta和Tannat/SO4組合（＜0.05）?！瓸eta’‘SO4’ ‘1103P’等3種砧木嫁接的‘丹娜’葡萄果實各類花色苷含量較低。2019年，Tannat/101-14組合和自根苗中花翠素類花色苷含量顯著高于Tannat/1103P和Tannat/Beta組合（＜0.05），Tannat/101-14組合和自根苗中甲基花翠素和花青素含量顯著高于Tannat/Beta組合（＜0.05）。對于不同酰化類型的花色苷，2016年，各個砧穗組合非?；ㄉ蘸鸵阴；ㄉ諆H在自根苗和Tannat/SO4組合中表現(xiàn)出差異，Tannat/ 1103P組合的香豆?；涂Х弱；ㄉ蘸匡@著高于自根苗、Tannat/101-14和Tannat/SO4組合（＜0.05）。2017年，自根苗葡萄果實非?；ㄉ蘸孔罡撸愿绾蚑annat/101-14組合乙?；ㄉ?、香豆酰化花色苷、咖啡?；ㄉ蘸匡@著高于其他組合（＜0.05）。2019年，Tannat/1103P組合和自根苗中香豆?；ㄉ蘸匡@著高于Tannat/Beta和Tannat/101-14組合，Tannat/101-14組合和自根苗咖啡?；鸵阴；惢ㄉ蘸匡@著高于Tannat/Beta組合（＜0.05）。

表2 不同砧穗組合‘丹娜’葡萄花色苷的組成和含量（mg?kg-1FW）

Table 2 Anthocyanin compositions and contents (mg?kg-1FW) in Tannat grape of different rootstock combinations

雙因素方差分析檢驗?zāi)攴?、處理和年份×處理差異的顯著性水平（ns：不顯著；*：＜0.05；**：＜0.01；***：＜0.001）。下同

Two-factor ANOVA was used to test the level of significance of differences in vintages, treatment, and vintages × treatment (ns: No significant; *:＜0.05; **:＜0.01; ***:＜0.001). The same as below

年份和砧木的雙因素方差分析結(jié)果表明，砧木對所有類型花色苷均具有顯著影響，4種砧木都有降低甲基花青素類、甲基花翠素類、花青素類、非?；?、乙?；?、香豆?；惢ㄉ盏内厔?。年份對花翠素類、花青素類、甲基花翠素類、甲基花青素類、二甲花翠素類、總花色苷類、乙酰化、香豆?；⒖Х弱；惢ㄉ沼酗@著影響。除花翠素類花色苷外，其他類型花色苷均受到砧木和年份的交互影響。

2.4 砧木對‘丹娜’葡萄黃酮醇含量的影響

‘丹娜’葡萄自根苗及其砧穗組合葡萄果實的果皮中共檢測出11種黃酮醇類物質(zhì)，且各樣品中檢測到的黃酮醇類別相同，‘丹娜’葡萄果皮中主要包括3種楊梅酮類、4種槲皮素類、1種西伯利亞落葉松黃酮類、2種山奈酚類、1種異鼠李亭類和1種丁香亭類黃酮醇。由表3可知，在成熟的果實中，槲皮素類黃酮醇物質(zhì)是含量最高的黃酮醇，楊梅酮次之，丁香亭和西伯利亞落葉松黃酮類黃酮醇物質(zhì)所占比例較小。2016年，Tannat/Beta組合果皮總黃酮醇與自根苗和其他砧穗組合無顯著差異，但總含量顯著高于Tannat/SO4組合（＜0.05）。另外，Tannat/Beta組合槲皮素類和西伯利亞落葉松黃酮類黃酮醇物質(zhì)含量也顯著高于Tannat/SO4組合（＜0.05）。Tannat/101-14組合的總黃酮醇含量也相對較高，各類型黃酮醇也均高于Tannat/1103P組合。而在2017年，‘丹娜’葡萄自根苗果皮總黃酮醇含量要高于的嫁接苗。對于不同類型的黃酮醇，同樣以‘丹娜’葡萄自根苗和Tannat/101-14組合較高。Tannat/SO4組合楊梅酮、山奈酚、槲皮素、異鼠李素等含量均顯著較低，丁香亭類和西伯利亞落葉松黃酮類黃酮醇類物質(zhì)與其他砧穗組合差異較小。2019，Tannat/101-14總黃酮醇含量最高，與自根苗無顯著差異，剩余3種砧穗組合黃酮醇含量較低。雙因素方差分析結(jié)果表明，年份對山奈酚和異鼠李素類黃酮醇物質(zhì)呈現(xiàn)出極顯著差異（＜0.01），對其他類型黃酮醇類物質(zhì)的影響不顯著。砧木對于楊梅酮類和西伯利亞落葉松黃酮類黃酮醇物質(zhì)具有極顯著影響，4種砧木都不同程度降低了‘丹娜’葡萄楊梅酮類和西伯利亞落葉松黃酮類黃酮醇物質(zhì)的含量。年份和砧木對除山奈酚類和丁香亭類黃酮醇之外的其他類型黃酮醇具有共同影響。

表3 不同砧穗組合‘丹娜’葡萄黃酮醇的組成和含量(mg?kg-1 FW)

2.5 砧木對‘丹娜’葡萄黃烷醇含量的影響

‘丹娜’葡萄果皮中的游離黃烷醇主要包括3種基本單元，分別為兒茶素（C）、表兒茶素（EC）和表棓兒茶素（EGC）。由表4可知，在果皮中，2016—2017年，以Tannat/101-14組合黃烷醇總含量最高；2019年Tannat/101-14組合與自根苗和其他組合果皮總黃烷醇含量無顯著差異。對于游離單元%，2016年，不同砧穗組合無顯著差異；2017年，自根苗游離單元%最高，Tannat/1103P最低；2019年，自根苗與Tannat/101-14和Tanant/Beta無顯著差異，Tannat/1103P游離單元%最低。對于延伸單元，3年試驗中，不同砧穗組合之間差異較小，以Tannat/101-14組合較高。對于末端單元%，2016—2017年，以Tannat/101-14組合最低；2019年各砧穗組合之間無顯著差異。雙因素方差分析結(jié)果表明，年份對果皮中的游離單元%有極顯著影響（＜0.01），對延伸單元%、末端單元%、總黃烷醇含量有顯著影響（＜0.05），而砧木僅對果皮中黃烷醇游離單元%有極顯著影響。年份和砧木共同影響了果皮中游離單元%。

表4 不同砧穗組合‘丹娜’葡萄黃烷醇的組成和含量（mg?kg-1 FW）

2.6 正交偏最小二乘回歸分析

為了進(jìn)一步探究不同砧木對‘丹娜’葡萄中次級代謝產(chǎn)物的影響，建立OPLS-DA模型進(jìn)行差異分析。結(jié)果如圖2所示，其中Tanant/SO4組合用2016—2017年數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，剩余組合用2016、2017、2019年3年數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，建立的OPLS-DA的模型第一主成分（豎軸方向上）可以很好地將不同砧穗組合與自根苗區(qū)分開來，且模型經(jīng)過200次置換檢驗后，無過度擬合現(xiàn)象。一般而言，Q2Y值>0.5則表示模型有良好的預(yù)測能力，由表5可知，本試驗構(gòu)建的模型R2X、R2Y、Q2Y值均在0.656—0.999，說明模型可靠且篩選差異性化合物的能力良好。通過模型篩選VIP>1的化合物發(fā)現(xiàn)，與自根苗相比，Tannat/101-14組合差異化合物是香豆?；谆ù渌睾鸵阴；谆ù渌兀籘annat/Beta組合主要差異化合物香豆?；谆ù渌?、乙?；谆ù渌亍⒁阴；谆ㄇ嗨?、乙?；谆ù渌?、香豆酰化甲基花翠素、槲皮素葡萄糖酸苷；而Tannat/SO4組合與自根苗差異化合物是香豆?；谆ù渌?、乙?；谆ù渌?、乙?；谆ㄇ嗨?、乙酰化甲基花翠素、香豆?；谆ù渌?、槲皮素葡萄糖酸苷。Tannat/1103P組合差異化合物主要是乙?；谆ù渌?、乙?；谆ㄇ嗨?、乙?；谆ù渌?、槲皮素類、香豆?；谆ù渌?。綜上，在眾多類黃酮物質(zhì)中，嫁接苗和自根苗相比，花色苷是最主要的差異化合物，且花色苷以二甲花翠素類為主。

A—D分別表示T與101-14，T與1103P，T與Beta，T與SO4的OPLS-DA分布圖

表5 基于類黃酮化合物構(gòu)建的OPLS-DA模型參數(shù)

3 討論

3.1 砧木影響‘丹娜’葡萄的理化指標(biāo)

砧木對‘丹娜’葡萄的影響，首先體現(xiàn)在果實基本理化指標(biāo)方面。從3年的結(jié)果看，砧木對‘丹娜’葡萄果實的百粒重影響并不是很大，但對于可溶性固形物，與其他砧木相比，砧木101-14嫁接的‘丹娜’葡萄含量較高，說明101-14可以促進(jìn)‘丹娜’葡萄可溶性固形物的積累。同時，對于果汁可滴定酸，4種嫁接苗中，101-14同樣有降低‘丹娜’葡萄中果汁可滴定酸的趨勢。由此可知，砧木101-14一方面增加了可溶性固形物的積累；另一方面也加速了可滴定酸的分解，進(jìn)而促進(jìn)果實成熟。盡管與自根苗相比，差異較小，但對于嫁接苗，101-14顯著加速果實成熟。李敏敏等[33]在‘赤霞珠’中也有類似的發(fā)現(xiàn)。

3.2 砧木影響‘丹娜’葡萄的類黃酮物質(zhì)含量

釀酒葡萄果實中花色苷、黃酮醇、黃烷醇等類黃酮物質(zhì)是釀酒品質(zhì)的重要參考指標(biāo)，一般而言，葡萄果實中類黃酮物質(zhì)越豐富，釀出的葡萄酒酒體越飽滿、骨架感越強(qiáng)。類黃酮化合物是苯丙烷代謝途徑中代謝物種類最多的分支途徑，基本結(jié)構(gòu)為C6-C3-C6，即兩個酚羥基的苯環(huán)（A環(huán)與B環(huán)）通過中央三碳原子（C環(huán)）相互連結(jié)而成的一系列化合物。根據(jù)C環(huán)的不同修飾，可將類黃酮化合物分為花色苷、黃酮醇、黃烷醇等[34-35]。葡萄果實類黃酮的生物合成又有2個分支：一個是類黃酮-3'-羥基化酶（F3'H）介導(dǎo)的花青素類花色苷的合成途徑；另一個是類黃酮-3'5'-羥基化（F3'5'H）介導(dǎo)的花翠素類花色苷的合成途徑[36]。本研究得出，二甲花翠素類花色苷是受砧木影響最大的類黃酮代謝物，而二甲花翠素類花色苷是類黃酮-3'5'-羥基化（F3'5'H）介導(dǎo)路徑合成的，因此，推測砧木有可能是通過調(diào)節(jié)代謝流向使接穗果實中類黃酮物質(zhì)的合成受到了影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，相對于其他3種砧木，砧木‘101-14’有利于果皮中花色苷、黃酮醇、黃烷醇的積累，但與自根苗相比，并沒有顯著優(yōu)勢。與此相反，砧木‘SO4’不利于‘丹娜’葡萄中花色苷、黃酮醇、黃烷醇的積累。有文獻(xiàn)報道，‘SO4’降低了‘赤霞珠’葡萄果實大部分單體花色苷的濃度，與本研究結(jié)果一致[27]。李敏敏等[33]以7種砧木嫁接‘赤霞珠’葡萄，發(fā)現(xiàn)‘101-14’顯著提高了果實花色苷含量，與本研究結(jié)果一致。但也有文獻(xiàn)報道‘140R’‘SO4’有利于‘美樂’葡萄果實花色苷的積累，‘101-14’和‘1103P’不利于接穗品種花色苷的積累[28]，這種差異可能是由于不同的接穗品種和環(huán)境因素造成的，不同的砧穗組合之間的嫁接親和性不同，不同的生長環(huán)境也會造成砧穗組合之間的生長產(chǎn)生差異，這種差異進(jìn)而可能會影響果實中類黃酮物質(zhì)的含量。此外，在‘黑格雷克’（Greco Nero）、‘麗晶’（Regent）葡萄的砧木嫁接試驗中，砧木‘5BB’‘125AA’也在不同程度上提高了葡萄果實中花色苷的含量[37-38]。關(guān)于砧木對接穗黃酮醇含量影響的研究，目前報道較少。有研究發(fā)現(xiàn)‘5A’‘Harmony’和‘Riparia Gloire’有促進(jìn)‘赤霞珠’黃酮醇合成的趨勢[27]，不同砧木嫁接的‘湯姆森無核’葡萄果實槲皮素含量無顯著影響[39]。黃酮醇的積累與光照關(guān)系較為密切，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，2017和2019年光照較為充足的年份，黃酮醇含量普遍較高，說明充足的光照有利于黃酮醇的積累。同時發(fā)現(xiàn)在嫁接苗中，CS/101-14組合的花色苷和黃酮醇含量都較高，說明101-14對于花色苷和黃酮醇的積累有促進(jìn)作用。對于果皮中的黃烷醇，‘5BB’嫁接的‘黑格雷克’果皮中EC和C含量較高[37]。WANG等[27]也發(fā)現(xiàn)砧木‘Ganzin 1’抑制‘赤霞珠’葡萄果皮黃烷-3-醇的積累。也有研究發(fā)現(xiàn)‘SO4’‘110R’促進(jìn)了‘美樂’果皮中的黃烷醇含量積累。砧木‘Sori’與‘161-49’‘125AA’‘5BB’‘Borner’相比，顯著增加了‘麗晶’葡萄的黃烷醇含量[38]。本研究發(fā)現(xiàn)各砧穗組合之間黃烷醇含量差異不大，說明砧木對黃烷醇含量影響較小。

綜上，不同砧木對接穗果實中的花色苷、黃酮醇、黃烷醇均有顯著影響。之所以會產(chǎn)生不同的影響，一方面是因為砧木對營養(yǎng)物質(zhì)、水分等利用與同化能力不同，使接穗的營養(yǎng)生長和生殖生長發(fā)生了改變，進(jìn)而影響了果實的表型以及類黃酮等次級代謝物的分泌。如‘101-14’由河岸葡萄和沙地葡萄雜交而來，樹勢中庸，有促進(jìn)果實成熟的趨勢。而‘1103P’由冬葡萄和沙地葡萄雜交而來，樹勢旺盛、根系發(fā)達(dá)?！甋O4’由冬葡萄和河岸葡萄雜交而來，樹勢中庸，根系較淺，豐產(chǎn)性強(qiáng)。‘貝達(dá)’由美洲葡萄和河岸葡萄雜而來，抗寒能力強(qiáng)。這些砧木獨(dú)特的遺傳特性賦予了接穗不同的性狀表達(dá)。另外，砧木自身的根系分泌物、富集的微生物也各不相同[40]，這也導(dǎo)致了接穗的生長發(fā)育發(fā)成了改變；砧木中遺傳物質(zhì)如miRNA可以在砧木和接穗中移動，也可能造成了接穗中調(diào)控類黃酮物質(zhì)代謝的酶含量的變化，甚至引起關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，從而調(diào)控了果實的發(fā)育，使果實中的類黃酮代謝產(chǎn)生差異。

基于此，初步推測在雨熱同期的氣候條件下，有促進(jìn)成熟的趨勢砧木，更利于果實類黃酮物質(zhì)的積累；而樹勢旺盛，豐產(chǎn)能力強(qiáng)的砧木，不利于果實類黃酮物質(zhì)的積累。關(guān)于砧木對果實表型的改變，導(dǎo)致類黃酮代謝物含量差異的機(jī)理，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在北京地區(qū)，‘101-14’有利于可溶性固形物的積累，而‘1103P’‘SO4’和‘貝達(dá)’等3種砧木不利于可溶性固形物的積累?！?01-14’嫁接的‘丹娜’葡萄花色苷、黃酮醇、黃烷醇等類黃酮物質(zhì)積累較多，有利于釀酒品質(zhì)的提升，推薦使用；而‘SO4’嫁接的‘丹娜’葡萄花色苷、黃酮醇、黃烷醇等類黃酮物質(zhì)積累較少，不推薦作為砧木使用。

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Effects of Different Rootstocks on Flavonoids ofL. cv. Tannat Grape Fruits

Center for Viticulture & Enology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University/Key Laboratory of Viticulture and Enology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100083

【Objective】Flavonoids are important metabolites of wine grapes, which have important effects on the qualities of the grape fruits and their wines. In this study, the effects of different rootstocks on the physicochemical parameters and flavonoid substances of Tannat (L.) grapes were studied to provide the theoretical basis for the selection and utilization of rootstocks.【Method】In the present research, Tannat shoots were used as scions and were greenwood grafted on four different kinds of rootstocks, including 1103P, 101-14, SO4, and Beta. On the bases of the analysis of the basic physicochemical parameters (total soluble solid content, titratable acid, pH, and 100-berry weights) of the commercial mature grape berries of these grapevines grafted on different rootstocks, the compositions and contents of the flavonoids in the corresponding grape berries were detected by using high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS), in the three vintages of 2016, 2017 and 2019.【Result】 The rootstocks had little effect on the 100-berry weights of the Tannat grapes; the contents of the total soluble solids were higher in the combination of Tannat/101-14, as well as the own-rooted Tannat; the titratable acids of the grape juice of the Tannat/101-14 and the Tannat/Beta combinations were higher than the own-rooted Tannat grapes. In the part of flavonoids, the contents of anthocyanins and flavonols in the Tannat/SO4 combination was the lowest in all of these combinations; the concentrations of anthocyanins and flavonols in the Tannat/101-14 combination and the own-rooted Tannat were higher than those of other combinations; the concentrations of flavanols in the skins of the Tannat/101-14 combination was higher. In addition, the concentrations of anthocyanins and flavonols in the Tannat/ 11103P combination was lower, but the content of flavanols in the skins of the Tannat/1103P combination was relatively high. Besides, the results of two-factor ANOVA of the year and the rootstock showed that the rootstocks had significant effects on all types of anthocyanins. All the four rootstocks showed a tendency of reducing the anthocyanins of peonidin, petunitin, malvidin, non-acylation, acetylation and coumaric acylation. In the mature fruits, the quercetins were the most abundant flavonols, followed by myricetins, while syringetins and laricitrins accounted for a smaller proportion. Rootstocks had a significant effect on the myricetins and laricitrins, which reduced the contents of myricetin and laricitrin to different degrees. Through the establishment of OPLS-DA (Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis) model, it was found that the Tannat/101-14 combination was mainly distinguished by the malvidin anthocyanin compared with the own-rooted grapes. The main difference compounds of Tannat/Beta combination were anthocyanins of malvidin, delphinidin and acetylation, the total flavanols and quercetin compounds. The difference compounds of the Tannat/SO4 combination were anthocyanins of malvidin, delphinidin, acetylation, and quercetins. The Tannat/1103P combination mainly consisted of acetylated anthocyanins and quercetins.【Conclusion】 In Beijing region, all the four rootstocks (1103P, SO4, Beta, and 101-14) showed a tendency of reducing the flavonoid concentrations, including anthocyanins of peonidin, petunitin, malvidin, non-acylation, acetylation, coumaric acylation quercetins, and laricitrins. The rootstock '101-14' was beneficial to the accumulation of anthocyanins, flavonols and flavanols in fruit skins, which was conducive to the improvement of the wine quality, so it was recommended to be used. However, Tannat grapes grafted with SO4 had less flavonoid accumulation, which was not recommended to be used.

wine grape; Tannat; rootstock; flavonoid; high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)

2021-09-07；

2021-12-31

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韓曉，Tel：18801311676；E-mail：hanxiaoke55@126.com。通信作者何非，Tel：13811574410；E-mail：wheyfey@cau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.10.011

（責(zé)任編輯 趙伶俐）