徽式臘肉刀板香中優(yōu)勢微生物的分離鑒定

朱旱林，徐寶才，黃千里

摘? 要：刀板香作為一種傳統(tǒng)的徽派腌臘肉制品，品質(zhì)優(yōu)良、風(fēng)味獨(dú)特，但生產(chǎn)工藝相對落后、品質(zhì)不穩(wěn)定，因此，需要對刀板香中優(yōu)勢微生物的分離鑒定及相應(yīng)發(fā)酵劑研制的需求迫切。通過低溫選擇性培養(yǎng)和分子生物學(xué)鑒定，共分離得到5 株葡萄球菌（4 株馬胃葡萄球菌和1 株木糖葡萄球菌）、6 株嗜冷菌（1 株小束噬脯氨酸菌、1 株沙雷氏菌和4 株嗜冷桿菌），進(jìn)一步測馬胃葡萄球菌（A3）、木糖葡萄球菌（A4）、小束噬脯氨酸菌（L1）和嗜冷桿菌（N17）的溫度適應(yīng)、耐鹽和耐乙醇能力。結(jié)果表明：菌株A3和A4有較好的耐鹽能力，菌株L1和A4對溫度的適應(yīng)能力較好，4 株菌對于乙醇的耐受性均較差。因此，篩選得到菌株A3和A4可作為良好的發(fā)酵劑，菌株L1和N17有作為低溫發(fā)酵劑的潛力。

關(guān)鍵詞：刀板香;優(yōu)勢微生物;發(fā)酵劑;分離純化;鑒定;耐受性

Isolation and Identification of Dominant Microorganisms in “Daobanxiang” Cured Meat

ZHU Hanlin， XU Baocai， HUANG Qianli*

（School of Food and Biological Engineering， Heifei University of Technology， Heifei? ? ?230009， China）

Abstract： As a traditional Huizhou-style cured meat product， Daobanxiang （DBX） has excellent quality and unique flavor. As its production technology is relatively outdated and its quality is unstable， there is an urgent need to isolate and identify the dominant microorganisms in DBX and develop starter cultures for its production. Through low temperature selective culture and molecular biological identification， four strains of Staphylococcus equinovarus， one strain of S. xylose， and six strains of psychrophilic bacteria， including one strain of Prolinoborus fasciculus， one strain of Serratia and four strains of Psychrobacter were obtained. Furthermore， the salt tolerance， temperature acclimation and ethanol tolerance of S. equinovarus A3， S. xylose A4， Prolinoborus fasciculus L1 and Psychrobacter N17 were determined. It turned out that S. equinovarus A3 and S. xylose A4 had better salt tolerance， P. fasciculu L1 and S. xylose A4 had better adaptability to temperature， and all the four strains had weak tolerance to ethanol. Strains A3 and A4 can be used as good starter cultures， and strains L1 and N17 have the potential to be used in low-temperature fermentation.

Keywords： Daobanxiang; dominant microorganism; starter cultures; isolation and purification; identification; tolerance

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220322-021

中圖分類號：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：

引文格式：

朱旱林， 徐寶才， 黃千里. 徽式臘肉“刀板香”中優(yōu)勢微生物的分離鑒定[J]. 肉類研究， 2022， 36（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220322-021.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHU Hanlin， XU Baocai， HUANG Qianli. Isolation and identification of dominant microorganisms in “Daobanxiang” cured meat [J]. Meat Research， 2022， 36（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220322-021.? ? http：//www.rlyj.net.cn

腌臘制品在我國有著上千年的歷史，深受人們的喜愛。生肉經(jīng)過腌制和成熟后，肉色臘紅，耐貯存，有著獨(dú)特的腌臘風(fēng)味[1-2]。傳統(tǒng)腌臘肉制品開放式的制作模式、漫長的制作周期以及適宜微生物生長的條件，是滿足微生物繁殖、代謝的絕佳天然培養(yǎng)基[3-4]。加之千百年的工藝傳承、特定的區(qū)域環(huán)境，一定程度上是對相關(guān)微生物的定向馴化與選擇，或許也正是因此才成就了我國多種地區(qū)性腌臘肉制品。

刀板香是安徽黃山地區(qū)特有的一種腌臘肉制品，由當(dāng)?shù)赝霖i肉制成，肥而不膩，具有極強(qiáng)的地域特色，這與黃山地區(qū)獨(dú)特的氣候環(huán)境有著密不可分的關(guān)系，但難以實(shí)現(xiàn)異地生產(chǎn)。黃山屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，獨(dú)特的水土環(huán)境和氣候條件使得當(dāng)?shù)匦纬闪霜?dú)特穩(wěn)定、成分復(fù)雜且難以復(fù)制的微生物群落環(huán)境，這也可能是刀板香獨(dú)特風(fēng)味形成的主要因素。刀板香原料采用徽州地區(qū)土雜豬厚度均勻的五花肉，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下（溫度、濕度），經(jīng)預(yù)處理、腌制、晾曬（輕發(fā)酵）等核心工藝加工而成，具有典型特征品質(zhì)，是體現(xiàn)濃郁地方特色的中式傳統(tǒng)肉制品。微生物可通過自身分泌的豐富酶系參與肉制品發(fā)酵中的一系列過程，如脂肪氧化[5-6]、蛋白質(zhì)降解[7-8]、碳水化合物水解[9]等，生成醛、酸、酮、酯和短肽等物質(zhì)，而這些物質(zhì)存在的量及相互間的比例，對區(qū)域腌臘肉制品獨(dú)特風(fēng)味和色澤的形成影響顯著。

究竟哪些微生物在腌臘肉制品風(fēng)味形成過程中起重要作用？黃艾祥[10]研究云南干腌火腿品質(zhì)特征形成規(guī)律及微生物對其品質(zhì)特征形成的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微生物將火腿中蛋白質(zhì)、脂肪降解生成一系列的游離氨基酸和脂肪酸。此外，Lizaso等[11]研究西班牙干腌香腸成熟過程中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)高亞硝酸細(xì)菌和微球菌引起蛋白質(zhì)的水解，導(dǎo)致香腸中游離氨基酸含量增加，對最終的感官品質(zhì)形成具有重要作用。Zhao Dandan等[12]研究不同發(fā)酵階段干腌魚風(fēng)味與微生物之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌是干腌魚發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌屬，參與發(fā)酵過程風(fēng)味的形成。Prado等[13]研究西班牙傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中微生物的作用，發(fā)現(xiàn)主要微生物為植物乳桿菌，該菌有效抑制了腐敗微生物的生長并促進(jìn)了風(fēng)味的形成?？梢?，不同的腌臘肉制品中有不同的優(yōu)勢微生物。從中篩選出產(chǎn)生最初產(chǎn)品獨(dú)特風(fēng)味、優(yōu)良品質(zhì)的菌種并研發(fā)發(fā)酵劑成為新的趨勢。

目前，較多研究直接將已知的發(fā)酵劑應(yīng)用到肉制品中，據(jù)此分析不同發(fā)酵劑對特定肉制品品質(zhì)的影響，如Ravyts[14]、Stahnke[15]、Hu Yingying[16]等將發(fā)酵劑直接應(yīng)用到干腌香腸中。從傳統(tǒng)的肉制品中分離，并通過一系列篩選得到具有良好發(fā)酵性能的菌株，有助于新發(fā)酵劑的開發(fā)。不同發(fā)酵肉制品具有不同的特征，其中關(guān)鍵發(fā)酵微生物的篩選標(biāo)準(zhǔn)并不一致，因此需要對傳統(tǒng)肉制品建立符合其特征的篩選體系。刀板香作為一種傳統(tǒng)的徽派腌臘肉制品，仍然依賴作坊式生產(chǎn)，工藝相對落后、品質(zhì)不穩(wěn)定，已經(jīng)不適于現(xiàn)代社會的需求;其中優(yōu)勢微生物的分離鑒定及相應(yīng)發(fā)酵劑研制的需求迫切。本研究組前期[17]采用高通量測序技術(shù)對不同加工階段刀板香中的微生物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)刀板香的主要優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌和嗜冷桿菌，這與刀板香生產(chǎn)環(huán)境為低溫環(huán)境相吻合。鑒于此，本研究在低溫環(huán)境下對刀板香的優(yōu)勢菌屬進(jìn)行選擇性分離培養(yǎng)，采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和分子生物學(xué)的方法對分離純化的微生物進(jìn)行菌株鑒定，以獲得在刀板香風(fēng)味形成過程中發(fā)揮重要作用的菌株，進(jìn)而建立刀板香發(fā)酵劑的篩選體系，對于優(yōu)良微生物種質(zhì)資源的挖掘以及地方傳統(tǒng)特色腌臘肉制品的規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)均有重要意義。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料與試劑

刀板香冬季成品取自安徽黃山全江生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司。

MSA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染色液、產(chǎn)H2S培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基、生化鑒定管? ?廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、Taq酶、引物、Marker、瓊脂糖? ?生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2? ?儀器與設(shè)備

ME204E-02型電子分析天平? ? 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;Synergy H1酶標(biāo)儀? ?美國BioTek儀器公司;BSD-150型振蕩培養(yǎng)箱? ?上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;AC2-4S1型超凈工作臺? ?蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3? ?方法

1.3.1? ?樣品制備

原料在低溫下使用粗鹽腌制，輔以少量的白酒和香辛料，腌制時間為30 d。腌制結(jié)束后經(jīng)過冷水洗鹽，然后轉(zhuǎn)移到室外晾曬30 d左右，晾曬后進(jìn)行真空包裝即得到成品。

1.3.2? ?菌株的分離和純化

依據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[18]并進(jìn)行部分修改。在無菌條件下，稱取10 g刀板香樣品于無菌均質(zhì)袋中，再加入90 mL生理鹽水，利用拍打式均質(zhì)機(jī)將樣品拍打1～2 min，制成1︰10的樣品勻液，然后將其進(jìn)行10 倍梯度稀釋為質(zhì)量濃度分別為10-3、10-4、10-5 g/mL，分別涂布于MRS培養(yǎng)基，放置于10 ℃培養(yǎng)48 h，涂布于LB培養(yǎng)基，放置于4 ℃培養(yǎng)7 d左右，挑取生長狀況良好的單菌落，劃線分離純化2～3 次。

1.3.3? ?形態(tài)學(xué)觀察

將分離純化得到的菌株分別在MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況，并通過革蘭氏染色和顯微鏡觀察其菌落狀態(tài)，選取革蘭氏陽性菌株。

1.3.4? ?菌株篩選實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)黏性實(shí)驗(yàn)：直接挑取平板上的單菌落觀察，篩選出不產(chǎn)黏液的菌株。

發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)[19]：將平板上的菌株接種于葡萄糖發(fā)酵管（內(nèi)置杜氏小管）中，放置于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，若內(nèi)置倒管內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，則菌株產(chǎn)氣。

產(chǎn)過氧化氫實(shí)驗(yàn)[20]：用接種環(huán)挑取平板上的單菌落于無菌玻片上，滴加一滴體積分?jǐn)?shù)3%的過氧化氫試劑，觀察是否有氣泡產(chǎn)生。

產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)[19]：用接種針挑取平板上的單菌落穿刺接種于H2S生化鑒定管中，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，若顯黑色則呈陽性，否則為陰性，篩選出不產(chǎn)H2S的菌株。

產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)[19]：將待測菌株接種于產(chǎn)氨培養(yǎng)基中，以不接種作為空白對照，37 ℃培養(yǎng)24 h，在菌液中加入3～5 滴奈氏試劑，有黃色或棕紅色沉淀出現(xiàn)者為陽性，無沉淀為陰性，篩選出不產(chǎn)氨的菌株。

硝酸鹽還原酶實(shí)驗(yàn)[21]：挑取平板上的單菌落接種于硝酸鹽還原酶的生化鑒定管中，培養(yǎng)18～24 h后，加入硝酸鹽還原試劑甲、乙液各2 滴，混勻，若顯深紅色則為陽性，篩選出硝酸鹽還原酶陽性的菌株。

氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)[20]：將待測菌株接種于氨基酸脫羧酶生化鑒定管的實(shí)驗(yàn)管和對照管中，并加入滅菌液體石蠟5～8 滴覆蓋培養(yǎng)基表面;培養(yǎng)18～24 h，若實(shí)驗(yàn)管為黃綠色，對照管變黃，則呈陽性，篩選氨基酸脫羧酶陰性的菌株。

蛋白酶檢測實(shí)驗(yàn)[22]：將待測菌株以點(diǎn)種法接種于酪蛋白檢測培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h后，在菌落周圍滴加10 g/100 mL三氯乙酸溶液，若菌落周圍有透明圈出現(xiàn)，則為陽性。

脂肪酶檢測實(shí)驗(yàn)[22]：將待測菌株以點(diǎn)種法接種于脂肪酶檢測培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h后，若菌落顏色變紅，則為陽性。

1.3.5? ?分子生物學(xué)鑒定

挑取平板上的單菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，取1.5 mL菌液12 000 r/min離心2 min后，棄去上清，然后按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒說明書操作，所得的基因組利用0.02 g/mL瓊脂糖凝膠電泳查看提取結(jié)果。

16S rDNA擴(kuò)增序列所用引物，正向引物為27F：5′-AGAGCCTGGCTCAGTTTGAT-3′;反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系（50 μL）：上、下游引物各1 μL、模板DNA1 μL、2×Taq Master Mix 25 μL、dd H2O 21μL[23]。

將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，獲得16S rRNA基因序列。測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析比對。

1.3.6? ?菌株生長曲線和耐受特性測定

菌株生長曲線測定：將篩選得到的菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h測1 次600 nm波長處光密度（OD600 nm）。

菌株對溫度適應(yīng)能力：將篩選得到的菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分別在4、10、15、25、37、45 ℃培養(yǎng)24 h后，測其OD600 nm。

菌株耐鹽能力測定：將篩選得到的菌株接種于鹽（NaCl）質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8 g/100 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，測其OD600 nm。

菌株耐乙醇能力測定：將篩選得到的菌株接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0%、3%、6%、9%、12%的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，測其OD600 nm。

1.4? ?數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)測定均重復(fù)3 次，使用Excel 2019軟件（Microsoft，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，使用Origin 2020軟件（OriginLab，USA）進(jìn)行繪圖。使用MEGA 7軟件（version 7.0，Mega Limited，Auckland，New Zealand）對分離、純化優(yōu)勢菌株的測序結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?細(xì)菌的菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果

通過對刀板香中葡萄球菌和嗜冷菌的選擇性分離培養(yǎng)，MSA培養(yǎng)基得到35 株菌株，LB培養(yǎng)基得到40 株菌株。MSA培養(yǎng)基形成圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、不透明的菌落，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后形成淺黃色、圓形、邊緣整齊、不透明的菌落。通過革蘭氏染色和鏡檢，共篩選到27 株革蘭氏陽性葡萄球菌和32 株革蘭氏陰性嗜冷菌。

2.2? ?菌株篩選結(jié)果

利用發(fā)酵劑的主要目的是縮短加工周期，改善肉制品的質(zhì)地、風(fēng)味和色澤，延長食品的貨架期[24]。因此對于發(fā)酵劑的篩選主要有以下標(biāo)準(zhǔn)：不產(chǎn)黏液、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、過氧化氫酶陽性、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)氨、具有較高的亞硝酸鹽還原酶活性和不具有氨基酸脫羧酶活性[25]。

對于革蘭氏染色和鏡檢后篩選到的菌株進(jìn)一步篩選，由表1可知，27 株葡萄球菌和32 株嗜冷菌不產(chǎn)黏液，20 株葡萄球菌和26 株嗜冷菌不產(chǎn)氣，18 株葡萄球菌和20 株嗜冷菌不產(chǎn)H2S，15 株葡萄球菌和19 株嗜冷菌不產(chǎn)氨，13 株葡萄球菌和14 株嗜冷菌具有亞硝酸鹽還原酶活性，8 株葡萄球菌和6 株嗜冷菌不具有氨基酸脫羧酶活性。

將這些初步篩選到的菌株作進(jìn)一步脂肪酶和蛋白酶活性檢測實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)共有5 株葡萄球菌和6 株嗜冷菌具有較強(qiáng)的蛋白酶和脂肪酶活性。

2.3? ?分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

通過篩選得到5 株葡萄球菌和6 株嗜冷菌，將葡萄球菌分別命名為A3、A4、A7、A10、A11，嗜冷菌分別命名為L1、N1、L17、N3、N17、T7。將這些菌株的擴(kuò)增序列測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，選取同源性≥99%的菌株序列，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[26]。發(fā)現(xiàn)這幾株菌中有3 株菌與馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）序列相似度達(dá)到99%，2 株與木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）序列相似度達(dá)到99%，1 株與小束噬脯氨酸菌（Prolinoborus sp.）序列相似度達(dá)到99%，1 株與沙雷氏菌（Serratia sp.）序列相似度達(dá)到99%，4 株與嗜冷桿菌（Psychrobacter faecalis）序列相似度達(dá)到99%。由于發(fā)酵劑的選擇需要具有蛋白酶和脂肪酶活性，葡萄球菌具有較好的脂肪酶和蛋白酶活性，小束噬脯氨酸菌具有脂肪酶活性，而嗜冷桿菌則具有耐受低溫特性，因此選取1 株馬胃葡萄球菌A3、1 株木糖葡萄球菌A4、1 株小束噬脯氨酸菌L1、1 株嗜冷桿菌N17制作系統(tǒng)發(fā)育樹。

由圖1可知，菌株A3與Staphylococcus equorum strain PA 231和Staphylococcus equorum strain ATCC 43958在同一個分支上，且通過Bootstrap的驗(yàn)證具有較高的置信度，因此可以將菌株A3初步確定為馬胃葡萄球菌。菌株A4與Staphylococcus xylosus strain JCM 2418在同一分支上，且通過Bootstrap的驗(yàn)證具有較高的置信度，因此可以將菌株A4初步確定為木糖葡萄球菌。菌株L1與Prolinoborus fasciculus strain CIP 103579在同一分支上，且通過Bootstrap的驗(yàn)證具有較高的置信度，因此可以將菌株L1初步確定為小束噬脯氨酸菌。菌株N17與Psychrobacter pulmonis strain CCUG 46240在同一分支上，且通過Bootstrap的驗(yàn)證具有較高的置信度，因此可以將菌株N17初步確定為嗜冷桿菌。

大多數(shù)肉制品中分離的微生物主要為乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌和霉菌等菌株，這些微生物可以分解蛋白質(zhì)，是發(fā)酵肉制品風(fēng)味物質(zhì)的主要來源[27-28]，也是篩選的發(fā)酵劑的主要來源。本實(shí)驗(yàn)從刀板香分離得到的馬胃葡萄球菌和木糖葡萄球菌，都是肉制品中常見的發(fā)酵微生物。Irlinger等[29]從法國干酪中分離出馬胃葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)它有助于發(fā)酵食品香氣的形成。Hu Meizhong等[30]從中國培根中篩選分離得到1 株木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus P2），將其接種到肉制品中，發(fā)現(xiàn)是肉制品良好的發(fā)酵劑。Xiao Yaqing等[31]將木糖葡萄球菌接種到中國傳統(tǒng)干腌肉制品中，發(fā)現(xiàn)接種后肉制品的游離氨基酸和游離脂肪酸含量均增加。張?jiān)娨鈁32]、陳學(xué)云[33]等分別從威寧火腿和鹽干帶魚中分離得到木糖葡萄球菌和馬胃葡萄球菌。目前，對于小束噬脯氨酸菌和嗜冷桿菌的研究較少，小束噬脯氨酸菌可能參與肉制品脂肪氧化過程，嗜冷桿菌可以很好地適應(yīng)低溫環(huán)境，還需要對這2 株菌株作進(jìn)一步研究。

2.4? ?菌株生長情況和生長適應(yīng)性測定結(jié)果

通過分子生物學(xué)共鑒定出11 株菌株，選取其中1 株馬胃葡萄球菌A3、1 株木糖葡萄球菌A4、1 株小束噬脯氨酸菌L1和1 株嗜冷桿菌N17，分別進(jìn)行下一步的生長情況和耐受實(shí)驗(yàn)測定。

2.4.1? ?菌株的生長情況

檢驗(yàn)發(fā)酵劑中的功能菌能否在肉制品生產(chǎn)過程中生長良好是發(fā)酵劑的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由圖2可知：在0～2 h內(nèi)，菌株處于遲緩期，OD600 nm變化不大;培養(yǎng)2 h后，菌株A3、A4和L1進(jìn)入指數(shù)期，菌株N17在培養(yǎng)4 h后進(jìn)入指數(shù)期，OD600 nm顯著上升，這說明菌株A3、A4和L1的調(diào)整期較短，能夠快速繁殖，此時菌株的生長旺盛，活力最強(qiáng);菌株A3在培養(yǎng)24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株A4在培養(yǎng)16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株L1和N17在培養(yǎng)30 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株L1處于指數(shù)期時間最長，說明在發(fā)酵過程中可以長時間保持活力最強(qiáng)的狀態(tài)，有著很好的發(fā)酵能力。到達(dá)穩(wěn)定期后，菌株A3、A4、L1和N17的OD600 nm分別為2.4、2.5、2.6和2.9，活菌數(shù)都可以達(dá)到109 CFU/mL。

2.4.2? ?菌株適應(yīng)溫度的能力

溫度在發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)過程起著至關(guān)重要的作用，一般情況下，發(fā)酵肉制品的腌制溫度為4 ℃，發(fā)酵溫度為20～25 ℃，因此對溫度的適應(yīng)能力也是發(fā)酵劑的一項(xiàng)重要指標(biāo)[34]。

由圖3可知：菌株A3和A4在4～37 ℃溫度條件下，隨著溫度的升高生長能力不斷增強(qiáng);菌株L1在4～25 ℃溫度條件下，隨著溫度的升高生長能力不斷增強(qiáng);菌株N17在4～20 ℃溫度條件下，隨著溫度的升高生長能力不斷增強(qiáng)。菌株A3和A4在37 ℃培養(yǎng)，生長能力較其他溫度有顯著提高，且其他溫度下生長能力較低，說明這2 株菌株的溫度適應(yīng)能力較差。菌株L1和N17的最適生長溫度分別為25 ℃和20 ℃，且在20～37 ℃菌株的生長能力較好，說明這2 株菌株的溫度適應(yīng)能力較好，因此對于較低溫環(huán)境生產(chǎn)的發(fā)酵肉制品有著一定發(fā)酵作用。低溫環(huán)境可以抑制大多數(shù)腐敗菌的生長，可以有效延長產(chǎn)品的貨架期，這2 株菌對于開發(fā)低溫生產(chǎn)發(fā)酵肉制品有一定的潛力。4 株菌株在4、10、45 ℃下生長能力都較差，說明4 株菌株在較低溫和高溫狀態(tài)下生長能力都較差。但是肉制品的發(fā)酵溫度一般在25 ℃左右，所以4 株菌株都能適應(yīng)肉制品的發(fā)酵溫度。

2.4.3? ?菌株的耐鹽能力

耐鹽能力是選擇發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的另一項(xiàng)重要指標(biāo)，一般發(fā)酵肉制品的鹽含量均為6.0%～9.0%[35-36]，這對于發(fā)酵肉制品的風(fēng)味形成和安全性有重要的影響[37-38]。由圖4可知，菌株A3和A4在NaCl質(zhì)量濃度為0～6 g/100 mL時，其生長能力較強(qiáng)，OD600 nm變化不明顯，在NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/100 mL時，菌株的生長能力受到一定程度的抑制，OD600 nm稍有下降，這說明菌株A3和A4有著較好的耐鹽能力，適合作為肉制品發(fā)酵劑。菌株L1和N17在NaCl質(zhì)量濃度為0～4 g/100 mL時，其生長能力較強(qiáng)，而在NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/100 mL以上時，菌株的生長能力受到較大程度的抑制，且在NaCl質(zhì)量濃度為8 g/100 mL時，菌株基本不生長，說明菌株L1和N17對鹽的耐受性較差，盡管發(fā)酵肉制品中鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為6.0%～9.0%，但由于目前發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)都朝著低鹽的方向發(fā)展，加上發(fā)酵劑自身所帶有的抑菌作用，對于鹽的添加量可以適當(dāng)降低，所以小束噬脯氨酸菌和嗜冷桿菌具有作為肉制品發(fā)酵劑的潛力。

2.4.4? ?菌株的耐乙醇能力

在刀板香腌制的過程中都會添加少量的白酒用于殺菌去腥，因此菌株對于乙醇的耐受能力也是篩選發(fā)酵劑的重要指標(biāo)。由圖5可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%～3%時，4 株菌株的生長能力較強(qiáng)，OD600 nm變化不明顯，而在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時，菌株的生長能力有較大程度的下降，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到9%時，菌株的生長能力完全受到抑制，基本不生長。這說明4 株菌株對于乙醇的耐受程度較低，但由于發(fā)酵肉制品中添加的白酒含量較少，且在加工過程中有大部分揮發(fā)，所以耐乙醇能力對于菌株作為發(fā)酵劑影響較小。

3? ?結(jié)? 論

本研究對刀板香的優(yōu)勢微生物進(jìn)行分離純化，并通過生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定篩選得到4 株具有脂肪酶和蛋白酶活性、可作為發(fā)酵劑的菌株，包括2 株葡萄球菌A3和A4、1 株小束噬脯氨酸菌L1和1 株嗜冷桿菌N17。對4 株菌株作進(jìn)一步的生物學(xué)特性和發(fā)酵特性分析，結(jié)果表明：菌株A3和A4分別在培養(yǎng)24、16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株L1和N17在培養(yǎng)30 h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株A3和A4生長較迅速，菌株L1在生長過程中可以長時間保持活力最強(qiáng)狀態(tài)，有較好的發(fā)酵潛力;菌株A3和A4對于溫度的適應(yīng)性較差，而菌株L1和N17對于溫度的適應(yīng)性較好，對于低溫發(fā)酵肉制品的開發(fā)有著一定的潛力;菌株A3和A4有著較好的食鹽耐受能力，而L1和N17的耐鹽能力則較差;4 株菌株對于乙醇的耐受能力均較差。菌株A3和A4可作為良好的發(fā)酵劑，L1和N17有作為低溫發(fā)酵劑的潛力。對刀板香的優(yōu)勢微生物進(jìn)行分離純化并對其發(fā)酵潛能進(jìn)行研究，對于后續(xù)刀板香的工藝改善和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)有很好的借鑒作用。

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