基于HPLC法測定車前子不同炮制品中主成分含量差異*

魏 峰 丁 燕 彭睿芳 洪桂芳 盛軍華 葉喜德※

（1.江西省撫州市東鄉(xiāng)區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，江西 東鄉(xiāng) 331800；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004；3.平樂縣源頭鎮(zhèn)衛(wèi)生院藥劑科，廣西 平樂 542406）

車前子為我國常用中藥之一，為車前科植物車前（Plantago asciatica L.）或平車前（Plantago depressa Will d.）的干燥成熟種子。主要分布于江西、黑龍江、遼寧等地，為江西道地藥材之一。本品味甘性寒，入腎、膀胱、肝、肺經(jīng)，具滲濕通淋、清熱利尿、明目、祛痰等藥理作用，臨床上一般用來醫(yī)治水腫脹滿、熱淋澀痛、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽等病癥[1]。

現(xiàn)代研究表明，車前子主含環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、多糖等成分[2]，而京尼平苷酸是其主要有效成分，為一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有降血糖及抗炎等作用[3]；毛蕊花糖苷也是其主要有效成分，為一種苯乙醇苷類化合物，可促進(jìn)小鼠樹突狀細(xì)胞的成熟，具有消炎、抗腫瘤、抗衰老、改善記憶、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等作用[4]?，F(xiàn)今對車前子的炮制方法主要為凈制、炒制、鹽制[5]，文獻(xiàn)對于車前子中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的測定研究較多[6-9]，但有關(guān)于測定車前子不同炮制品中的京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量報道很少，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷為車前子藥材質(zhì)量指標(biāo)成分。故本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用通過高效液相色譜法（HPLC），比較車前子不同炮制品中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量差異，為車前子及其炮制品的質(zhì)量評價提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為深入研究車前子炮制作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫儀器有限公司）；GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；YF-111B（100 g）高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；FA1004N萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑 車前子藥材來自安徽匯仁堂中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為車前科植物車前Plantago asiatica L.的干燥成熟種子。京尼平苷酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkp20082603，純度：HPLC＞98%），毛蕊花糖苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-20092315），供含量測定用，純度：HPLC＞98.73%）購于成都曼思特生物科技有限公司。水為娃哈哈飲用純凈水，乙腈為色譜純，磷酸、甲醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 車前子不同炮制品的制備

2.1.1 凈制車前子 取原車前子藥材，除去枝，梗等雜質(zhì)，篩去灰屑，即得。

2.1.2 清炒車前子 將凈制車前子倒入炒鍋內(nèi)，用文火炒至表面微黃、有爆裂聲時，取出放涼，即得。

2.1.3 鹽制車前子 將凈制車前子倒入炒鍋內(nèi)，用文火炒至有爆裂聲時，將該炒鍋中車前子倒入新的炒鍋，再噴灑鹽水，繼續(xù)炒干，有香味逸出時，取出放涼，即得。凈制車前子與食鹽的比例為50∶1。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取車前子藥材粉末（過2號篩）約1 g，精密加入60%甲醇50 mL，加熱回流2 h，放置在室溫下，等冷卻后，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。取濾液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液，取1 mL注入樣品瓶中，即為上樣分析樣品，將制備好的樣品置于4℃下保存，待測。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取京尼平苷酸、毛蕊花糖苷對照品各1 mg，加60%甲醇溶解并定容，制備成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。分別取對照品適量，制備成質(zhì)量濃度為京尼平苷酸0.4 mg/mL和毛蕊花糖苷0.25 mg/mL的混合對照品溶液，即得，待測。

2.4 色譜條件 色譜柱：RD-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸水溶液為流動相B，梯度洗脫（0～7 min，14%A；7～27 min，14%～24%A）；流速：1 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：10μL。在該色譜條件下，車前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷與其他化學(xué)成分的色譜峰分離度良好。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）、生車前子（B）、炒車前子（C）、鹽車前子（D）的HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項(xiàng)下方法制備的京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的混合對照品溶液4、6、8、12、16、20μL，分別按照“2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積，以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。計(jì)算得京尼平苷酸的線性回歸方程為Y＝232.67X+318.5，r＝0.999；毛蕊花糖苷的線性回歸方程為Y＝205.86X+504.43，r＝0.999。結(jié)果表明，京尼平苷酸在1.6～8.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，毛蕊花糖苷在1.0～5.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下方法制備的對照品溶液10μL，按照“2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的峰面積并以峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果京尼平苷酸峰面積的RSD為0.14%，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.25%，表明該儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h分別進(jìn)樣測定，記錄京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的峰面積并以峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果京尼平苷酸峰面積的RSD為1.43%，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.21%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批車前子藥材粉末（過2號篩）6份，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的峰面積并用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量和RSD。結(jié)果京尼平苷酸峰面積的RSD為0.33%，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 樣品含量測定 分別取凈制車前子、清炒車前子、鹽制車前子粉末各3份，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，含量測定結(jié)果見表1。

表1 車前子不同炮制品含量測定結(jié)果 (%)

3 討論與小結(jié)

3.1 炮制方法的選擇 古代對車前子的炮制主要有凈制、炒制、酒制等法，而現(xiàn)代主要采用凈制、炒制、鹽制等。把酒制改為鹽制，這可能是因?yàn)榫浦茣?dǎo)致車前子中某些活性成分的散失，而鹽制對這些活性成分影響相對較少[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用凈制、炒制、鹽制等法。但在鹽制過程中，發(fā)現(xiàn)噴灑鹽水容易使車前子結(jié)塊，且因?yàn)槌村仠囟雀邥?dǎo)致鹽水蒸發(fā)掉，食鹽易粘連在鍋底，故而在文火炒至有爆裂聲時，將車前子倒入新的炒鍋內(nèi)，噴灑鹽水，炒干，至有香味逸出時取出放涼。

3.2 流動相的確定 通過查閱文獻(xiàn)，前期先后選用了甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%醋酸、乙腈-水這5種系統(tǒng)作為流動相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用乙腈-0.1%磷酸作為流動相，梯度洗脫，分離效果最好。即圖譜中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的峰型好，與其他雜質(zhì)峰的分離度高，保留時間適中，京尼平苷酸的保留時間為3.76 min，毛蕊花糖苷的保留時間為22.46 min。因而選用乙腈-0.1%磷酸作為流動相，對車前子藥材進(jìn)行分析。

3.3 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)通過HPLC對生車前子、炒車前子、鹽車前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量進(jìn)行測定，得生車前子中京尼平苷酸平均含量為1.77%、毛蕊花糖苷平均含量為1.29%；炒車前子中京尼平苷酸平均含量為1.89%、毛蕊花糖苷平均含量為1.10%；鹽車前子中京尼平苷酸平均含量為1.82%、毛蕊花糖苷平均含量為1.13%。根據(jù)現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》中車前子藥材的含量測定規(guī)定，車前子干燥品中的京尼平苷酸含量不得少于0.50%，毛蕊花糖苷不得少于0.40%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)車前子各炮制品均符合2020版《中華人民共和國藥典》中車前子藥材含量規(guī)定。

由含量測定結(jié)果可知，不同炮制品中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷含量存在差異，生車前子經(jīng)炮制后京尼平苷酸含量有所增加，而毛蕊花糖苷有所降低。因此，基于HPLC法測定車前子不同炮制中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量可反映不同炮制方法對車前子有效成分產(chǎn)生影響，為深入研究車前子炮制機(jī)制及飲片質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。