P16、Ki67在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)及相關(guān)性研究

周劉勇 劉倩文 李燕紅

宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（cervical squamous intraepithelial lesion，CIN）屬于宮頸癌前病變的一種，其發(fā)病是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，經(jīng)歷宮頸良性疾病、CIN、鱗狀細(xì)胞癌，其過(guò)程涉及多個(gè)基因改變，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控[1]。數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，CIN好發(fā)于26～65歲女性，患者發(fā)病多與高危型人乳頭狀瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HPV）感染有關(guān)[2]。因此，加強(qiáng)宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者診斷，對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義[3]。病理組織檢查是CIN診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，能確定病灶性質(zhì)、嚴(yán)重程度，可指導(dǎo)臨床診療，但是該診斷方法在不同病理醫(yī)師之間的一致性有較大差異，尤其在病變CIN1、CIN2級(jí)。P16在臨床上使用較多，其表達(dá)水平異常能反映HPV感染情況，可反映細(xì)胞的調(diào)節(jié)、增殖，且在正常組織中表達(dá)水平較低[4]；Ki67是核抗原的一種，能影響細(xì)胞的增殖、分化，且在靜止期不會(huì)表達(dá)，其表達(dá)水平被視為對(duì)細(xì)胞群體的增殖活性進(jìn)行精準(zhǔn)反饋的重要指標(biāo)[5]。因此，本研究以宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者為研究對(duì)象，探討P16、Ki67在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織中的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年5月—2021年2月宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者90例作為觀察組，年齡24～65歲，平均（39.93±10.41）歲；病程4～21個(gè)月，平均（10.59±3.21）個(gè)月；體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）18 ～ 29 kg/m2，平均（23.23±3.41）kg/m2；低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變30例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變60例（其中CIN2級(jí)35例、CIN3級(jí)25例）；所有患者均經(jīng)活檢組織病理學(xué)確診，選擇同期治療的慢性宮頸炎患者20例為對(duì)照組，年齡26～63歲，平均（40.11±11.23）歲；病程4～22個(gè)月，平均（10.63±3.26）個(gè)月；BMI 19～30 kg/m2，平均（23.41±3.45）kg/m2。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，患者或其家屬知情同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均為原發(fā)性宮頸疾病[6]，且患者具有完整的影像和臨床資料；（2）均完成P16、Ki67測(cè)定，且患者均可耐受；（3）病理檢查前均未行放化療，免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）精神異常，有認(rèn)知功能異?；蜓合到y(tǒng)疾病者；（2）器質(zhì)性疾病，伴有自身免疫系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重肝腎功能異常者；（3）凝血功能異常、全身感染性疾病者。

1.3 方法

（1）標(biāo)本采集。采集兩組病理標(biāo)本，置于福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制備4 μm切片，備用。（2）檢測(cè)方法。①測(cè)定步驟。采用LeicaBond-Max全自動(dòng)免疫組化儀（德國(guó)徠卡公司）測(cè)定各組P16、Ki67蛋白陽(yáng)性率。P16、Ki67為即用型工作液，均購(gòu)于邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，P16單克隆抗體（鼠單抗，克隆號(hào)：MX007），Ki67單克隆抗體（鼠單抗，克隆號(hào)：MX006）。上述操作完畢后進(jìn)行再?zèng)_洗，返藍(lán)。梯度乙醇對(duì)標(biāo)本脫水后在二甲苯的輔助作用下處理，中性樹(shù)膠封固（以鹽酸鹽緩沖液作為一抗陰性對(duì)照，利用已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照）在400倍顯微鏡下對(duì)不同標(biāo)本切片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野選擇細(xì)胞200個(gè)計(jì)數(shù)，上述所有操作嚴(yán)格遵循儀器、試劑盒說(shuō)明書(shū)完成[7]。②判定方法。不同組織測(cè)定完畢后，采用半定量方法進(jìn)行測(cè)定及判斷。0分：陽(yáng)性細(xì)胞占0%～10%；1分：陽(yáng)性細(xì)胞占11%～25%；2分：陽(yáng)性細(xì)胞占26%～50%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞占51%～75%；4分陽(yáng)性細(xì)胞＞75%。0～3分陰性，4～5分弱陽(yáng)性（+），6～7分中陽(yáng)性（++），8～12分強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[8]。（3）一致性分析。對(duì)于高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變患者分為CIN2和CIN3級(jí)，分析不同分級(jí)下P16、Ki67蛋白陽(yáng)性率，并對(duì)P16、Ki67在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達(dá)進(jìn)行一致性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件處理，計(jì)數(shù)和計(jì)量資料分別用率（%）和（）表示，分別采用χ2及t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組P16、Ki67陽(yáng)性率比較

兩組均完成P16、Ki67陽(yáng)性率測(cè)定，結(jié)果顯示，觀察組（低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變）P16、Ki67陽(yáng)性率均高于對(duì)照組（χ2=7.392、8.916，P＜0.05）；高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變中CIN3級(jí)患者P16、Ki67陽(yáng)性率高于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（χ2=5.691、8.525，P＜ 0.05），見(jiàn)表 1。

表1 兩組P16、Ki67陽(yáng)性率比較[例（%）]

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，觀察組P16表達(dá)于胞核與胞漿中，呈棕黃色；而Ki67定位于細(xì)胞核中，呈黃色，且CIN分級(jí)越高，顏色越深；而對(duì)照組慢性宮頸炎下免疫組化下多呈陰性，見(jiàn)圖1。

圖1 不同組織中HE及免疫組化結(jié)果（200×）

2.2 高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變中P16、Ki67一致性分析

高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變一致性分析結(jié)果顯示，宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中P16與Ki67無(wú)關(guān)聯(lián)性（P＞0.05）；而優(yōu)勢(shì)性檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變中P16、Ki67一致性分析（例）

3 討論

宮頸癌是臨床上發(fā)生率較高的婦科惡性腫瘤，全球每年新增病例約為50萬(wàn)，而我國(guó)每年新增病例為13.5萬(wàn)，成為影響女性健康的重要原因。而CIN作為宮頸癌發(fā)生前的病變，是宮頸癌防治的重要階段，且目前CIN的診斷與分級(jí)存在諸多主觀因素，影響臨床治療方案[9]。因此，臨床上尋找一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確判斷CIN及預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)歸的技術(shù)方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

CIN是一組宮頸癌前病變的總稱(chēng)，且對(duì)于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）來(lái)說(shuō)，65%的患者可以逆轉(zhuǎn)正常，20%的患者能維持穩(wěn)定，且15%的CIN1級(jí)可能進(jìn)一步發(fā)展。病理組織學(xué)檢查是CIN診斷金標(biāo)準(zhǔn)，能實(shí)現(xiàn)病灶的分期與診斷，為患者后續(xù)治療方案的制訂提供參考依據(jù)[10]。但是，傳統(tǒng)的病理學(xué)檢查在實(shí)際工作中存在諸多不足，如敏感性較低、可造成一定的誤診和漏診、可重復(fù)性較差等。研究顯示[11]，生物標(biāo)志物能較為全面地反映細(xì)胞群體的增殖活性，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的分化程度、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移存在緊密的聯(lián)系。P16最早由國(guó)外學(xué)者于1994年首次發(fā)現(xiàn)，屬于是一種細(xì)胞周期中的基本基因，在腫瘤細(xì)胞的分化、增殖中發(fā)揮了重要作用，可負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分裂，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。P16基因是一種能直接調(diào)控細(xì)胞周期的腫瘤抑制基因，通過(guò)阻止Rb基因的磷酸化，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，達(dá)到負(fù)性調(diào)控細(xì)胞增殖的目的。對(duì)于正常細(xì)胞周期中，P16表達(dá)水平較低或檢測(cè)不出，但是當(dāng)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受損時(shí)，將會(huì)引起P16增殖活躍并呈高表達(dá)[12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究?jī)?nèi)顯示[13]，P16基因缺失，突變后，將會(huì)引起腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，加強(qiáng)患者P16基因測(cè)定，可判斷腫瘤的易感性，對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要價(jià)值。本研究中，觀察組（低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變）P16、Ki67陽(yáng)性率均高于對(duì)照組（P＜0.05）；高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變中CIN3級(jí)患者P16、Ki67陽(yáng)性率高于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變患者（P＜0.05），提示P16、Ki67能直接參與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的發(fā)生、發(fā)展，亦可反映患者疾病嚴(yán)重程度，指導(dǎo)臨床診療。而Ki67在細(xì)胞增殖的各期中均有表達(dá)，但是在細(xì)胞靜止期G0不表達(dá)[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，Ki67的過(guò)度表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期具有正調(diào)控作用，能加快腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的增強(qiáng)，Ki67陽(yáng)性率表達(dá)并呈升高趨勢(shì)。因此，Ki67表達(dá)水平與諸多腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后存在緊密的聯(lián)系。既往研究顯示[17]，Ki67是核抗原，可影響細(xì)胞的增殖，Ki67過(guò)度表達(dá)，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞增殖活性高，能指導(dǎo)臨床治療。本研究中，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變一致性分析結(jié)果顯示，宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中P16與Ki67無(wú)關(guān)聯(lián)性（P＞0.05）；而優(yōu)勢(shì)性檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。因此，臨床上對(duì)于宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者應(yīng)加強(qiáng)其P16、Ki67測(cè)定，實(shí)現(xiàn)宮頸鱗狀上皮內(nèi)邊的早期診斷；對(duì)于確診的宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者，積極采取相應(yīng)的措施治療干預(yù)，加強(qiáng)患者P16、Ki67水平測(cè)定，評(píng)價(jià)患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療，使得患者的治療更具科學(xué)性，降低宮頸癌發(fā)生率[18]。

綜上所述，P16、Ki67在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者中呈高表達(dá)，且二者無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性，加強(qiáng)患者P16、Ki67聯(lián)合檢測(cè)能提高診斷準(zhǔn)確性，指導(dǎo)臨床診療。