膠原蛋白提取及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

張華 湯振業(yè) 趙浩然 儲(chǔ)李捺 孫廣冬

摘要：目前，隨著膠原蛋白在各相關(guān)行業(yè)中用量不斷增加，人們對(duì)其的研究愈發(fā)重視。膠原蛋白主要存在于水生動(dòng)物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)專業(yè)手段提取后應(yīng)用于食品、美容、醫(yī)療等領(lǐng)域中。本文主要就其提取方法和檢測(cè)方法展開綜述，旨在為今后的相關(guān)研究提供有力依據(jù)。

關(guān)鍵詞：膠原蛋白;提取方法;檢測(cè)方法

【中圖分類號(hào)】 G644.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2022）12--01

膠原蛋白主要分布于多細(xì)胞生物體內(nèi)，是其中含量最多且分布最為廣泛的蛋白質(zhì)之一，在蛋白質(zhì)總量中占比約在25%—35%，是締結(jié)組織的主要組成部分[1]。一般情況下，膠原蛋白提取來自于動(dòng)物屠宰后的廢棄物。此外，魚皮也是其主要原料之一。膠原蛋白不僅具有良好的理化性能和生物活性，同時(shí)還具備其他材料無可比擬的優(yōu)勢(shì)，那就是較高的生物相容性和可降解性。正是由于其具備的這些獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其被大量應(yīng)用于醫(yī)藥、美容、食品加工等行業(yè)中。隨著各行各業(yè)對(duì)膠原蛋白需求量的不斷增加，人們對(duì)其的研究也在逐步深入。本文主要就膠原蛋白的提取及檢測(cè)展開綜述。

1.膠原蛋白的提取方法

人們主要通過海洋生物和動(dòng)物組織獲得生產(chǎn)膠原蛋白的原材料，包括禽畜骨頭、肌腱、豬皮、魚鱗、魚皮等。而目前普遍認(rèn)為品質(zhì)最佳且污染較小的就是深海魚膠原蛋白，這也是膠原蛋白提取由動(dòng)物組織逐漸轉(zhuǎn)向海洋生物的主要原因。下圖為酸、酶法結(jié)合提取工藝圖。

1.1酸法提取

該方法主要通過酸性條件破壞膠原分子間的鹽鍵和Schiff鍵（一RC=N-）， 引起膠原纖維的膨脹、溶解，從而達(dá)到提取的目的。作為溶劑使用的酸主要有乙酸、檸檬酸、甲酸等。用酸法提取的膠原可以最大限度地保持其三股螺旋結(jié)構(gòu)，適用于生物醫(yī)用材料及其原料。但是酸處理后膠原的溶解量很少。與酶法相比這種方法提取率較低。

1.2酶法提取

酶法具有水解反應(yīng)快、無環(huán)境污染的優(yōu)點(diǎn)，且提取的水解膠原蛋白純度高、水溶性好、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。胃蛋白酶還可以催化水解膠原的端肽非螺旋區(qū)，而對(duì)螺旋區(qū)無作用，這樣溶解的膠原仍具有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)，更降低了膠原的抗原性，適用于生物醫(yī)用材料及其原料。

1.3鹽法提取

常用于提取膠原的中性鹽有氯化鈉、檸檬酸鹽等。在中性條件下，當(dāng)鹽的濃度達(dá)到一定量時(shí)，膠原就會(huì)發(fā)生溶解。膠原的溶解和分級(jí)受中性鹽效應(yīng)的影響，影響機(jī)理較為復(fù)雜。有的鹽可提高膠原的穩(wěn)定性，有的則可降低其構(gòu)象的穩(wěn)定性，不利于天然膠原的提取。

1.4堿法提取

由于堿容易造成肽鍵的水解，因此得到水解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量較低。水解過度時(shí)，易產(chǎn)生有毒性的D型氨基酸。因此，該方法不適合用于生物醫(yī)用材料膠原蛋白的提取。

2.膠原蛋白的檢測(cè)方法

2.1膠原蛋白種類檢測(cè)

2.1.1傅里葉紅外光譜檢測(cè)法

這種檢測(cè)方法是基于反射光源所產(chǎn)生的干涉光與分束器融合，從而使其獲取樣品信息，再利用傅里葉進(jìn)行轉(zhuǎn)換處理，形成展現(xiàn)透過率、波數(shù)、吸收度和波長關(guān)系的光譜圖，最終明確未知樣品中相關(guān)物質(zhì)的分子組成。有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)、氨基酸序列與酰胺三種帶的伸縮振動(dòng)具有密切相關(guān)性。

2.1.2紫外吸收光譜法

膠原蛋白內(nèi)含的能在紫外吸收光譜中出現(xiàn)吸收峰的不飽和鍵包括：-CO-NH-、-COOH、C6H6 以及多元芳香環(huán)，有學(xué)者通過研究提出，大多數(shù)蛋白質(zhì)在230nm波長下和280nm波長處會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，但對(duì)于只含有微量酪氨酸的膠原蛋白而言，卻只能在波長低于230nm以下才能出現(xiàn)強(qiáng)吸收，因此，可用其對(duì)蛋白質(zhì)中是否含有膠原蛋白進(jìn)行判定[2]。有學(xué)者特以此為依據(jù)，使用多種方法對(duì)東方鲀魚皮進(jìn)行膠原蛋白提取，結(jié)果顯示，強(qiáng)吸收峰的出現(xiàn)波長均在235nm左右，同時(shí)得出結(jié)論，膠原蛋白在利用酶處理后，其紫外吸收能力顯著提高，且結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生變化。

2.1.3磷酸緩沖鹽溶液和組織化學(xué)染色法

磷酸緩沖鹽溶液與膠原蛋白融合后，在溫度低至4℃條件下會(huì)以液態(tài)形狀出現(xiàn)，在溫度升高至38℃時(shí)會(huì)以固態(tài)形狀出現(xiàn)，這也是一種判定是否存在膠原蛋白的方法之一。組織化學(xué)染色法又包含天狼猩紅染色法、V.G染色法以及復(fù)合染色法。其中V.G染色法只能用來判定是否存在膠原蛋白，天狼猩紅則可對(duì)膠原蛋白的種類進(jìn)行分辨，同時(shí)還能測(cè)定其含量。而復(fù)合染色法可利用膠原蛋白所含的堿性物質(zhì)與酸性物質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)。

2.2膠原蛋白含量檢測(cè)

2.2.1高效液相色譜法

此法主要借助高壓輸液系統(tǒng)將各種溶液置入色譜柱，待相關(guān)成分處理完成后使用儀器進(jìn)行檢測(cè)分析。截至目前，已有相關(guān)學(xué)者將此方法應(yīng)用于多種原材料中膠原蛋白含量的測(cè)定，包括雞皮、蛇皮、鯽魚皮等。

2.2.2紫外分光光度法

紫外分光光度法在檢測(cè)過程中首先要對(duì)樣品的吸光度進(jìn)行測(cè)評(píng)，隨后根據(jù)波長與吸光度完成樣品的吸收譜圖繪制，明確λmax和λmin后，再根據(jù)特定的吸收值判定物質(zhì)含量。如，測(cè)定膠原蛋白含量時(shí)，要根據(jù)其吸光度設(shè)置曲線圖，在根據(jù)樣品的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系測(cè)出具體含量。

2.2.3羥脯氨酸比色法

當(dāng)膠原蛋白處于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿狀態(tài)下，遇高溫溶解后會(huì)產(chǎn)生羥脯氨酸，隨后以氯胺T氧化羥脯氨酸產(chǎn)生氧化物（內(nèi)含吡咯環(huán)），清除余下物質(zhì)后，在特定條件下，此氧化物遇到二甲氨基苯甲醛會(huì)產(chǎn)生紅色物質(zhì)，并可于558nm處檢出，再以標(biāo)準(zhǔn)曲線為依據(jù)將羥脯氨酸濃度進(jìn)行測(cè)定，最終得出膠原蛋白具體含量[3]。

3.結(jié)語

隨著社會(huì)及科技的不斷發(fā)展，膠原蛋白的應(yīng)用范圍愈來愈廣。在我國龐大生物資源的支持下，膠原蛋白的提取技術(shù)愈發(fā)成熟，從一定程度上提升了國內(nèi)生物資源的利用率。鑒于膠原蛋白的原材料大部分來源于動(dòng)物屠宰后的廢棄物，故而，膠原蛋白的提取對(duì)環(huán)境改善極為有利。但就目前來看，膠原蛋白的提取與檢測(cè)依然存在一些急需解決的弊端，包括新產(chǎn)品的研發(fā)、應(yīng)用以及膠原蛋白的純化問題等。相信在未來的發(fā)展中，對(duì)膠原蛋白的研究會(huì)更加深入，對(duì)其的提取和檢測(cè)方法會(huì)愈加先進(jìn)，膠原蛋白的應(yīng)用也會(huì)愈加廣泛。

參考文獻(xiàn)：

[1]沈曉麗，閆明俞，耿文寧，李海芳.骨膠原蛋白肽粉中DNA的提取及豬、羊源性成分的檢測(cè)[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2020，11（03）：945-949.

[2]林麗，薛為長，麥篤萍，唐蘭英，李明珍.魚皮膠原蛋白的提取與檢測(cè)研究綜述[J].內(nèi)江科技，2019，40（07）：94-95.

[3]盧韻君. 魚源膠原蛋白肽酶解工藝及其分子量檢測(cè)方法研究[D].華南理工大學(xué)，2016.