枳椇果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

黃蕭天，余佳梅，何 東，郭 賓，魏丕偉，王凌云*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644002；2.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644007；3.宜賓五糧液仙林生態(tài)酒業(yè)有限公司，四川 宜賓 644007）

枳椇（Hovenia acerbaLindl.）為鼠李科拐棗屬落葉喬木[1]，始載于《唐本草》，別名拐棗、龍爪、雞爪梨、萬壽果、木蜜、木珊瑚、金鉤子[1-2]等，兼具食用與藥用價值，被國家衛(wèi)計委列入食藥兩用中藥名單。枳椇的果梗成熟后，具有濃郁的香甜味和枳椇獨特的果香，口感柔和飽滿，汁液濃厚甜蜜。枳椇成熟的肉質果梗中含有豐富的營養(yǎng)成分和生理活性物質，主要包括枳椇皂苷[3]、生物堿-黑麥草堿[4-5]、脂肪酸、葡萄糖、粗蛋白、維生素C、微量元素[6-8]及多種活性黃酮類物質[9-11]。枳椇具有多種藥用功效，如解酒利尿[8]、防止酒精對肝臟的損傷[12-13]和抗肝纖維化[14]、抑制腫瘤細胞生長[15]、抗疲勞[16]、抑制食欲和減肥降脂[17-18]、治療腎結石[19]等，同時花梗中充分的多糖與黃酮賦予其良好的抗氧化能力[20]。

目前對枳椇有一些研究報道。黎繼烈等[21-22]分析了枳椇果梗的營養(yǎng)成分，并以其為原料釀制果酒，探討了的果酒釀造工藝，分析了果酒品質及經濟效益。市場上與枳椇有關的酒類產品主要是枳椇發(fā)酵酒、蒸餾酒、配制酒3個類型[23]，但對枳椇果酒的釀造工藝相關文獻報道較少。本研究以枳椇為原料釀制枳椇果酒，通過跟蹤監(jiān)測發(fā)酵后酒精度、酸度、糖度、總黃酮含量和感官評價等指標來確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，為枳椇果酒的產業(yè)化生產提供技術參考，為我國枳椇產業(yè)健康發(fā)展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳椇（Hovenia acerba）：陜西秦嶺；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W33、果膠酶（酶活為20 000 U）、酵母營養(yǎng)劑：法國LAFFORT公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：法國LAMOTHE-ABIET公司；蔗糖、皂土、硅藻土、殼聚糖（均為食用級）：鄭州萬博食品配料有限公司；蘆?。兌龋?8%）：合肥博美生化科技有限責任公司；無水乙醇、三氯化鋁、醋酸鉀（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

722N可見分光光度計、YP5001電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；DGX-9073B-2鼓風干燥機：上海?，攲嶒炘O備有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；PHS-3CpH計：杭州齊威儀器有限公司；PAL-1手持糖度計：成都格納絲商貿有限公司；PAL-36S酒精度計：杭州陸恒生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枳椇果酒加工工藝流程及操作要點

枳椇→挑選、清洗→60 ℃烘干→粉碎、打漿→接種酵母→主發(fā)酵→酒渣分離→后發(fā)酵澄清→貯藏→成品

操作要點：

枳椇預處理：取果柄肥碩，無霉變損壞的成熟果實，多次清洗后60 ℃條件下干燥12 h。

粉碎打漿：將預處理后的枳椇進行粉碎，經40目篩過篩。取枳椇粉末50 g到錐形瓶中，按料液比1∶8（g∶mL）加入純水。同時加入100 mg/L偏重亞硫酸鉀，0.04%的果膠酶，18%的蔗糖，50 mg/L酵母營養(yǎng)劑，用檸檬酸調pH值為5.5。

接種酵母：取2 g釀酒酵母W33倒入20 mL含5%蔗糖的37 ℃溫水中，充分攪拌后，活化20 min。添加0.20%的活化酵母液。

主發(fā)酵：主發(fā)酵時間為10 d，發(fā)酵溫度為28 ℃，定時振蕩搖勻與排氣，待pH和糖度趨于穩(wěn)定時，結束發(fā)酵。

酒渣分離：用100 目篩過濾。

后發(fā)酵澄清：向濾液中加入復合澄清劑：皂土6 g/L，硅藻土0.1 g/L，殼聚糖0.4 g/L，室溫下澄清2 d。經100目的篩過濾后真空泵抽濾，在9 ℃靜置2 d，取300 mL上清液。

貯藏：澄清后枳椇果酒于9 ℃條件下貯藏，得到枳椇果酒成品。

1.3.2 枳椇果酒的感官品評標準

枳椇果酒感官品評標準依據(jù)國家標準GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[24]，組織20人，其中20～30歲10人，30～40歲10人，男女各占一半，含兩位國家一級品酒師。對枳椇果酒從色澤、香氣、口感、澄清度4個方面進行綜合感官評分，滿分100分，感官評分取20人的平均值。

表1 枳椇果酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of Hovenia acerba fruit wine

續(xù)表

1.3.3 分析檢測

酒精度測定：酒精計；可溶性固形物：手持糖度計；pH值：pH計；酸度的測定：指示劑法[24]。

總黃酮含量的測定采用分光光度法[25]。蘆丁標準曲線的繪制：稱取蘆丁對照品10.00 mg，加入體積分數(shù)為95%乙醇定容至100 mL，吸取20.00 mL于另一100 mL容量瓶中，加入體積分數(shù)95%乙醇稀釋至刻度線，即得20 mg/L蘆丁標準品溶液。取蘆丁標準品溶液0 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于50 mL玻璃比色管中，先后加入2.00 mL 2.50 g/100 mL三氯化鋁溶液和2.00 mL 9.82 g/100 mL醋酸鉀溶液，加20%乙醇溶液稀釋至刻度線，搖勻，設置樣品空白對照。在波長415 nm處測定其OD415nm值（吸光度值），平行測定3次，取平均值。以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標、吸光度值（y）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。按照標準曲線回歸方程計算枳椇果酒中總黃酮含量。

1.3.4 枳椇果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

單因素試驗設計：以酒精度、感官評價為主要評價指標，總黃酮含量、酸度、糖度為輔助評價指標。分別考察主發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）；酵母添加量（0.08%、0.14%、0.20%、0.26%、0.32%）；蔗糖添加量（14%、16%、18%、20%、22%）；SO2添加量（30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L）對結果的影響。

正交試驗設計：根據(jù)單因素試驗結果，以感官評價、酒精度和總黃酮含量為評價指標，采用L9（33）正交試驗設計，優(yōu)化枳椇果酒發(fā)酵工藝。正交試驗因素與水平見表2。

表2 枳椇果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for Hovenia acerba fruit wine fermentation technology optimization

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的建立

以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標、吸光度值（y）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=0.011 9x+0.004 3，相關系數(shù)R2為0.999 3。結果表明，蘆丁標準品質量濃度在0～20 mg/mL范圍內與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線Fig. 1 Standard curve of rutin

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 主發(fā)酵溫度對枳椇果酒品質的影響

不同主發(fā)酵溫度對枳椇果酒感官品質的影響見表3。由表3可知，當發(fā)酵溫度在24～28 ℃范圍內的升高，感官評分隨之增高；當主發(fā)酵溫度為28 ℃時，感官評分最高為87.67分；當發(fā)酵溫度高于28 ℃之后，感官評分隨之下降。其原因可能是溫度過高，酵母代謝旺盛，代謝產物生成過多，影響酒的質量[26]。

表3 不同主發(fā)酵溫度對枳椇果酒感官品質的影響Table 3 Effect of different main fermentation temperature on sensory quality of Hovenia acerba fruit wine

不同主發(fā)酵溫度對枳椇果酒理化指標的影響見圖2。由圖2可知，隨主發(fā)酵溫度的升高，果酒的酒精度、酸度呈上升趨勢，而糖度呈下降趨勢，可能是酵母過量的生殖作用和代謝作用，消耗了糖，分解出酒精和酸類物質。當主發(fā)酵溫度為32 ℃，酒精度最高為16.23%vol，酸度最高為4.83 g/L，糖度最低為6.50°Bx；隨著主發(fā)酵溫度的升高，果酒的總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，當主發(fā)酵溫度為28 ℃，總黃酮含量達到最大為998.27 μg/mL。

圖2 不同主發(fā)酵溫度對枳椇果酒理化指標的影響Fig. 2 Effect of different main fermentation temperature on physicochemical indexes of Hovenia acerba fruit wine

綜上，選擇主發(fā)酵溫度28 ℃為宜。

2.2.2 酵母添加量對枳椇果酒品質的影響

不同酵母添加量對枳椇果酒感官品質的影響見表4。由表4可知，當酵母添加量在0.08%～0.20%范圍內增加，感官評分隨之增高；當酵母添加量為0.20%，感官評分最高為84.33分；當酵母添加量＞0.20%之后，感官評分隨之下降，可能是發(fā)酵的代謝產物增加，覆蓋枳椇原有的風味。

表4 不同酵母添加量對枳椇果酒感官品質的影響Table 4 Effect of different yeast addition on sensory quality of Hovenia acerba fruit wine

不同酵母添加量對枳椇果酒理化指標的影響見圖3。由圖3可知，隨酵母添加量的增加，果酒的酒精度呈緩慢上升趨勢，酸度呈下降趨勢，當酵母添加量為0.32%，酒精度最高為14.57%vol，酸度最低為5.43 g/L。隨著酵母添加量的增加，果酒的總黃酮含量、糖度呈先上升后下降的趨勢，當酵母添加量為0.26%，總黃酮含量達到最大為1 002.94 μg/mL；酵母添加量為0.20%，果酒的糖度最高為8.70°Bx。

圖3 不同酵母添加量對枳椇果酒理化指標的影響Fig. 3 Effect of different yeast addition on physicochemical indexes of Hovenia acerba fruit wine

綜上，選擇酵母添加量0.20%為宜。

2.2.3 蔗糖添加量對枳椇果酒品質的影響

不同蔗糖添加量對枳椇果酒感官品質的影響見表5。由表5可知，隨蔗糖添加量在14%～18%范圍內的增加，感官評分隨之增加；當蔗糖添加量為18%時，感官評分最高為85.67分；當蔗糖添加量≥22%之后，其酒液甜度就會掩蓋其酒味兒，色澤不夠透亮。

表5 不同蔗糖添加量對枳椇果酒感官品質的影響Table 5 Effect of different sucrose addition on sensory quality of Hovenia acerba fruit wine

不同蔗糖添加量對枳椇果酒理化指標的影響見圖4。由圖4可知，隨蔗糖添加量的增加，果酒的酒精度、酸度、糖度呈上升趨勢，當蔗糖添加量為22%，酒精度最高為17.07%vol，糖度最高為12.50°Bx，酸度最高為4.54 g/L，糖度最高為12.50°Bx。隨著蔗糖添加量的增加，果酒的總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，當蔗糖添加量為20%，總黃酮含量達到最大為896.50 μg/mL。

圖4 不同蔗糖添加量對枳椇果酒理化指標的影響Fig. 4 Effect of different sucrose addition on physicochemical indexes of Hovenia acerba fruit wine

綜上，選擇蔗糖添加量18%為宜。

2.2.4 SO2添加量對枳椇果酒品質的影響

不同SO2添加量對枳椇果酒感官品質的影響見表6。由表6可知，當SO2添加量在30～50 mg/L范圍內的增加，感官評分隨之增加；當SO2添加量50 mg/L時，枳椇果酒感官評分最高為84分；當SO2添加量＞50 mg/L之后，酒體會有酸味，協(xié)調性較差。

表6 不同SO2添加量對枳椇果酒感官品質的影響Table 6 Effect of different SO2 addition on sensory quality of Hovenia acerba fruit wine

不同SO2添加量對枳椇果酒理化指標的影響見圖5。由圖5可知，隨SO2添加量的增加，果酒的酒精度、酸度、糖度呈上升趨勢，當SO2添加量為70 mg/L，酒精度最高為14.33%vol，酸度最高為4.12 g/L，糖度最高為10.77°Bx。隨著SO2添加量的增加，果酒的總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，當SO2添加量為50 mg/L時，總黃酮含量達到最大為916.11 μg/mL。SO2的主要作用在于抑制雜菌生長以及抗氧化[27]，但當銅含量、SO2含量較高的情況下容易發(fā)生銅破敗。由于后發(fā)酵時期還會添加少量用于終止發(fā)酵，因此SO2用量不宜過高[28]。

圖5 不同SO2添加量對枳椇果酒理化指標的影響Fig. 5 Effect of different SO2 addition on physicochemical indexes of Hovenia acerba fruit wine

綜上，選擇SO2添加量50 mg/L為宜。

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，固定SO2添加量為50 mg/L，以主發(fā)酵溫度（A）、酵母添加量（B）、蔗糖添加量（C）為3個因素進行3因素3水平正交試驗，正交試驗結果與分析見表7，方差分析結果見表8～表10。

表7 枳椇果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for Hovenia acerba fruit wine fermentation technology optimization

表8 以酒精度為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiments results using alcohol content as evaluation index

表9 以感官評價為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory evaluation as evaluation index

表10 以總黃酮含量為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal experiments results using total flavone content as evaluation index

由表7可知，以酒精度為評價指標，根據(jù)極差大小結果可知，各因素對枳椇果酒酒精度影響的次序為A（主發(fā)酵溫度）＞C（蔗糖添加量）＞B（酵母添加量），最優(yōu)發(fā)酵工藝組合是A3B1C3。此優(yōu)化條件下，酒精度最高為16.80%vol。

以感官評分為評價指標，各因素對枳椇果酒感官評分影響的次序為A（主發(fā)酵溫度）＞C（蔗糖添加量）＞B（酵母添加量），最優(yōu)發(fā)酵工藝組合是A2B1C2。此優(yōu)化條件下，感官評分最高為92分。

以總黃酮含量為評價指標，各因素對枳椇果酒黃酮含量影響的次序為A（主發(fā)酵溫度）＞B（酵母添加量）＞C（酵母添加量），最優(yōu)發(fā)酵工藝組合是A2B3C1。此優(yōu)化條件下，總黃酮含量最高為1 123.39 μg/mL。

由表8可知，主發(fā)酵溫度、蔗糖添加量對枳椇酒酒精度皆有顯著影響（P＜0.05），而酵母添加量對枳椇酒酒精度的影響未達到顯著水平（P＞0.05）。

由表9可知，主發(fā)酵溫度、蔗糖添加量對枳椇酒酒精度皆有顯著影響（P＜0.05），而酵母用量對枳椇酒酒精度的影響未達到顯著水平（P＞0.05）。

由表10可知，主發(fā)酵溫度、蔗糖添加量、酵母添加量對枳椇酒總黃酮含量的影響未達到顯著水平（P＞0.05）。

根據(jù)方差分析可知，酒精度和感官評價中的主發(fā)酵溫度和蔗糖用量對試驗結果影響顯著，且溫度影響程度大于蔗糖用量。前期試驗發(fā)現(xiàn)，酒精度較高的樣品，其口感偏酸且感官評價偏低。綜合考慮，選擇最佳發(fā)酵工藝條件為感官評分最高的發(fā)酵工藝條件組合A2B1C2，即主發(fā)酵溫度28 ℃，酵母添加量0.14%，蔗糖添加量18%。該優(yōu)化條件下，枳椇果酒酒味協(xié)調，酒味醇厚，果香濃郁，酸甜適口。

3 結論

以酒精度、感官評價為主要評價指標，總黃酮含量、酸度、糖度為輔助評價指標，通過單因素試驗和正交試驗，得到了枳椇果酒發(fā)酵最佳工藝條件為：主發(fā)酵溫度28 ℃、酵母添加量0.14%、蔗糖添加量18%。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，枳椇果酒酒精度為13.7%vol，感官評分為92分，總黃酮含量為0.85 mg/mL，酸度為3.4 g/L，糖度為8°Bx，枳椇果酒色澤透亮，呈琥珀色。通過對枳椇果酒發(fā)酵條件的探索與優(yōu)化，為枳椇果酒的研究和生產提供一定的理論基礎。