加味柴芍六君湯減輕炎癥反應(yīng)在缺氧誘導(dǎo)的慢性萎縮性胃炎胃黏膜損傷中的保護(hù)作用研究

洪銀潔，涂文玲，傅頤，陳靜怡，朱景茹，甘慧娟，李旻

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以固有層腺體萎縮為主要病理特點(diǎn)的消化系統(tǒng)常見(jiàn)病，是“炎癌轉(zhuǎn)化”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。中醫(yī)學(xué)依據(jù)癥候表現(xiàn)將其歸屬于“胃痛”“胃痞”“嘈雜”等，CAG病機(jī)以本虛標(biāo)實(shí)為根本，脾胃虛弱為本，胃絡(luò)瘀血為標(biāo)，瘀血亦是CAG發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。IL-1β、IL-6屬于促炎細(xì)胞因子[2]，與CAG的“炎癌轉(zhuǎn)化”進(jìn)展密切相關(guān)，在檢測(cè)炎癥和評(píng)估CAG病情進(jìn)展方面具有重要參考價(jià)值。HIF-1α表達(dá)水平與細(xì)胞缺氧程度呈正相關(guān)[3]，CAG病久入絡(luò)，胃絡(luò)血運(yùn)不暢，瘀血內(nèi)阻，形成炎癥局部缺氧環(huán)境。加味柴芍六君湯在疏肝理氣、健脾和胃基礎(chǔ)上，加入丹參、莪術(shù)兩味中藥，兼顧活血祛瘀之效，能顯著改善臨床癥狀并促進(jìn)炎癥修復(fù)[4-6]，然而其逆轉(zhuǎn)CAG胃黏膜病理改變的分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究應(yīng)用加味柴芍六君湯治療CAG模型大鼠，通過(guò)HIF-1α表達(dá)變化以及IL-1β、IL-6含量來(lái)探討加味柴芍六君湯逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜病理改變的炎癥相關(guān)生物學(xué)機(jī)制，可以進(jìn)一步明確疏肝健脾化瘀治療CAG的效果，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

20只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量100～120 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2019-0005，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，屏障環(huán)境下，控制環(huán)境溫度21～24 ℃，空氣濕度50%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)規(guī)定，并取得福建中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物

加味柴芍六君湯組成包含柴胡6 g，白芍4.5 g，人參9 g，白術(shù)9 g，茯苓9 g，半夏4.5 g，陳皮3 g，炙甘草6 g，丹參9 g，莪術(shù)9 g，中藥飲片均購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院藥劑科。浸泡30 min后單蒸水煎煮2次，混合后濃縮至含生藥量0.69 g/mL的中藥煎液，經(jīng)潔凈紗布過(guò)濾后分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

脫氧膽酸鈉，批號(hào)20201209，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；25%～28%氨水，批號(hào)202008011，西隴科學(xué)股份有限公司；HE染色試劑盒，批號(hào)J21D10Y106492，上海源葉生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6) ELISA試劑盒，批號(hào)LOT20210510A，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，批號(hào)R401-01，Vazyme；逆轉(zhuǎn)錄試劑，批號(hào)AKF1919A，寶生物工程(大連)有限公司；PCR試劑，批號(hào)AK41790A，寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 儀器

RM2245型半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；5424R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppenddorf公司)；TissueLyser Ⅱ型組織研磨儀(Giagen公司)；RT6100型酶標(biāo)儀(Rayto公司)；Nanodrop 2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific)；QuantStudio6 Flex型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組6只，造模組14只。造模方法參照文獻(xiàn)[7]加以改進(jìn)，將脫氧膽酸鈉粉末溶于單蒸水中配成8.29 g/L的脫氧膽酸鈉溶液，將氨水溶于單蒸水中配制成3.78 mL/L的氨水溶液，用以造模組大鼠每日交替飲用，并配合饑飽失常(兩日飽食，一日停食)，循環(huán)往復(fù)，共16周。造模結(jié)束后隨機(jī)取2只造模組大鼠取材觀察胃黏膜組織病理形態(tài)，若出現(xiàn)固有層腺體萎縮，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)則提示造模成功。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、加味柴芍六君湯組，每組6只。

2.2 給藥

按人與動(dòng)物間藥物劑量換算的常規(guī)算法[8]，大鼠的給藥量約為人的6倍，正常組和模型組予等體積(10 mL/kg)生理鹽水灌胃，加味柴芍六君湯組予0.69 g/mL加味柴芍六君湯灌胃，每日1次。3組均連續(xù)干預(yù)4周。

2.3 取材

灌胃結(jié)束后，大鼠禁食不禁水24 h，稱(chēng)取大鼠體質(zhì)量，用20%烏拉坦(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉后迅速剖腹，行腹主動(dòng)脈采血。斷頭處死大鼠，取出全胃并從幽門(mén)處沿胃大彎剪開(kāi)胃腔，冰生理鹽水清洗干凈胃內(nèi)容物，取胃竇部修剪為5 mm×5 mm的組織塊放入4%的多聚甲醛溶液固定24 h，其余胃黏膜組織置于凍存管，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察及檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1 動(dòng)物一般情況及體質(zhì)量

觀察各組大鼠毛發(fā)色澤、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、糞便性狀等一般情況變化，并于造模前后、干預(yù)后分別記錄3組大鼠體質(zhì)量。

2.4.2 HE染色法觀察胃黏膜組織病理

將4%多聚甲醛固定后的胃黏膜組織取出，梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，撈片后烘干脫蠟，進(jìn)行HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)。

2.4.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定IL-1β、IL-6含量

按照ELISA試劑盒說(shuō)明配制標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將樣品吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各樣品中IL-1β、IL-6的實(shí)際濃度。

2.4.4 qPCR法檢測(cè)胃黏膜HIF-1α mRNA表達(dá)

將組織從-80 ℃冰箱取出冰上解凍，稱(chēng)取50 mg胃黏膜組織進(jìn)行RNA提取，經(jīng)75%乙醇清洗后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件。將反應(yīng)完的cDNA吸取1 μL用于下一步的qPCR反應(yīng)，其余放入-20 ℃儲(chǔ)存。按說(shuō)明書(shū)配制qPCR反應(yīng)體系，置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用β-actin作為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計(jì)算胃黏膜HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 胃黏膜組織β-actin、HIF-1α mRNA引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 模型評(píng)價(jià)

3.1.1 動(dòng)物一般情況及體質(zhì)量比較

正常組大鼠毛發(fā)潔白有光澤，活潑好動(dòng)，行動(dòng)敏捷，大便性狀氣味無(wú)殊；模型組大鼠毛發(fā)粗硬，色淡黃無(wú)光澤，無(wú)精打采，安靜扎堆，大便時(shí)干時(shí)稀，氣味臭穢；加味柴芍六君湯組大鼠毛發(fā)情況、精神狀況、活動(dòng)度、大便性狀等較模型組有明顯改善。造模前，正常組與造模組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。造模后，與正常組相比，造模組大鼠體質(zhì)量顯著減輕(P<0.01)，見(jiàn)表2。連續(xù)干預(yù)4周后，計(jì)算各組大鼠的體質(zhì)量增量。與正常組相比，模型組大鼠的體質(zhì)量增量下降(P<0.05)。與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠的體質(zhì)量增量顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表2 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量比較

表3 各組大鼠體質(zhì)量增量比較

3.1.2 胃黏膜組織病理比較

正常組大鼠胃固有層腺體排列整齊，未見(jiàn)腺體萎縮、減少；模型組大鼠胃黏膜固有層腺體排列紊亂，局部腺體萎縮、減少，腺腔增大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)多處散在出血點(diǎn)；與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠腺體排列較整齊，腺體萎縮改善，仍可見(jiàn)散在出血點(diǎn)。如圖1所示。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織HE染色病理圖(×400)

3.2 各組血清IL-1β、IL-6含量

與正常組相比，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6含量顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6含量比較

3.3 各組胃黏膜HIF-1α mRNA表達(dá)

與正常組相比，模型組大鼠胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)；加味柴芍六君湯組大鼠胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達(dá)量與模型組表達(dá)量相比有下調(diào)趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠胃黏膜組織HIF-1α表達(dá)水平比較

4 討論

CAG歸屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“胃痞”“嘈雜”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CAG病位在胃，與肝、脾密切相關(guān)，肝與脾在生理上密切相關(guān)，病理上相互影響[9-10]。“土得木而達(dá)”，脾土得肝木之疏泄，脾胃升降協(xié)調(diào)，運(yùn)化功能健旺；而“木賴(lài)土以培之”，脾為氣血生化之源，脾氣運(yùn)化水谷精微，輸送滋養(yǎng)肝木，才能發(fā)揮其正常的生理功能。血液的生成和循行同樣需要肝脾相互協(xié)作，脾氣健運(yùn)，氣血化源充足，肝血充足，則疏泄正常，氣機(jī)調(diào)暢，氣血運(yùn)行方能無(wú)阻。葉天士在《臨證指南醫(yī)案》中指出慢性遷延性疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律是“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)”，CAG病程長(zhǎng)，病情反復(fù)，血瘀是CAG病情進(jìn)展的關(guān)鍵因素[11-12]，肝郁脾虛是CAG的重要病理特點(diǎn)，而柴芍六君湯是臨床上治療慢性萎縮性胃炎肝郁脾虛型的常用方劑。本研究在柴芍六君湯的基礎(chǔ)上加入活血祛瘀、通經(jīng)止痛之丹參以及破血行氣、消積止痛之莪術(shù)組成加味柴芍六君湯，旨在探討加味柴芍六君湯針對(duì)肝郁脾虛血瘀病機(jī)治療CAG的炎癥相關(guān)生物學(xué)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物一般情況、體質(zhì)量以及胃黏膜組織病理形態(tài)比較來(lái)進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，模型組大鼠毛發(fā)粗硬，色淡黃無(wú)光澤，無(wú)精打采，安靜扎堆，大便時(shí)干時(shí)稀，氣味臭穢，成模大鼠體質(zhì)量較正常組大鼠顯著減輕，其宏觀表征符合肝郁脾虛的病機(jī)特點(diǎn)。模型組大鼠胃固有層腺體萎縮，符合CAG的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明CAG疾病模型已成功建立。

IL-1β是由單核-巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子，能引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)致使白細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，放大炎癥反應(yīng)，并通過(guò)影響炎癥與免疫二者平衡[13-14]，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化，在CAG胃黏膜炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，但I(xiàn)L-1β水平過(guò)高會(huì)損傷胃黏膜。研究顯示[15]，IL-1β水平在慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃癌3個(gè)階段有顯著差異，呈升高趨勢(shì)，并與胃癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。血清IL-6是可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞(B細(xì)胞和T細(xì)胞)參與機(jī)體免疫應(yīng)答，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的一種多效炎癥細(xì)胞因子[16]。較多研究表明[17-18]，IL-1β、IL-6在炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，可用于探討胃黏膜損傷的嚴(yán)重程度及炎癥分級(jí)。

HIF-1α是對(duì)缺氧水平產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)因子，可以激活多種缺氧反應(yīng)基因的表達(dá)，其在常氧環(huán)境下不穩(wěn)定，易被細(xì)胞內(nèi)氧依賴(lài)性泛素蛋白酶降解，但在缺氧環(huán)境下可以穩(wěn)定表達(dá)[19]。缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)常見(jiàn)特征，可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)水平上調(diào)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)能力[20]，增加CAG的癌變風(fēng)險(xiǎn)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組血清IL-1β、IL-6含量顯著升高，胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達(dá)水平較之正常組上調(diào)，表明CAG胃黏膜損傷程度較為嚴(yán)重，炎癥反應(yīng)明顯，胃黏膜局部缺氧環(huán)境形成，癌變風(fēng)險(xiǎn)增加。加味柴芍六君湯干預(yù)后IL-1β、IL-6含量顯著減輕，HIF-1α mRNA表達(dá)水平較模型組表現(xiàn)出下調(diào)的變化趨勢(shì)，說(shuō)明藥中病機(jī)，能促進(jìn)CAG胃黏膜損傷修復(fù)，減輕炎癥反應(yīng)，可能具有改善胃黏膜缺氧環(huán)境的作用，但效果不甚明顯。

綜上所述，加味柴芍六君湯可能是通過(guò)降低血清IL-1β、IL-6含量，下調(diào)胃黏膜缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α過(guò)表達(dá)，從而改善胃黏膜局部缺氧環(huán)境，減輕炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮。