基于高通量測序分析涼血解毒方對HBV相關慢加急性肝衰竭患者腸道菌群的影響

侯藝鑫， 張 群， 江宇泳， 于 浩， 楊玉英， 王憲波

首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院 中西醫(yī)結合中心， 北京 100015

慢加急性肝衰竭(ACLF)的臨床表現(xiàn)以極度乏力、嚴重消化道癥狀、黃疸、腹水及凝血功能障礙為主，突出的病理表現(xiàn)為廣泛肝細胞壞死[1]，病死率極高(50%～90%)[2-4]，目前，仍然是世界性難題。在我國，HBV感染所致ACLF最為多見，約占90%左右[5]，一旦發(fā)生ACLF，目前尚缺乏特效藥物。

近年來，人們對腸道菌群的認識逐漸深入。越來越多的研究通過16S rDNA和宏基因組等技術揭示出腸道菌群在慢性肝臟疾病中的改變[6]。北京地壇醫(yī)院中西醫(yī)結合中心以診治肝病為特色，多年來在中醫(yī)藥治療肝衰竭方面不斷的探索和總結，尤其在治療HBV相關ACLF(HBV-ACLF)方面積累了豐富的經驗?；贏CLF“熱、毒、瘀”的核心病機及病證癥相結合的治療理念，中西醫(yī)結合中心創(chuàng)立了“涼血解毒重通腑，健脾化濕顧中焦”的治療法則，并且在治療用藥方面獨具匠心。本研究采用體外模擬發(fā)酵實驗的方法分析涼血解毒方治療ACLF的腸道菌群特征，為進一步研究涼血解毒方治療HBV-ACLF的作用機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年10月—2019年10月于本院中西醫(yī)結合中心住院的HBV-ACLF患者，根據(jù)是否加涼血解毒方，分為HBV-ACLF用藥組與HBV-ACLF未用藥組。另選取同期健康志愿者作為對照(HP組)。

1.2 納入標準 HBV-ACLF入組標準：(1)診斷標準參考《肝衰竭診治指南(2012年版)》[7]；(2)年齡18～65歲。HP組納入標準：在本院住院HBV-ACLF患者家屬中，招募與疾病對象年齡、性別、地域相匹配的健康志愿者，病史調查顯示身體健康，無肝臟和胃腸道疾病史，既往無高血壓、糖尿病等其他系統(tǒng)性疾病，6個月內無手術史，肝腎功能無異常。

1.3 排除標準 重疊HAV、HCV、HEV等感染；合并自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、酒精性肝病及各種遺傳代謝性肝??；合并結核感染；HIV感染者；有嚴重心、腎等并發(fā)癥或合并其他原發(fā)性疾病者；惡性腫瘤患者；上消化道出血；肝腎綜合征；妊娠或哺乳期婦女；近1個月內應用過抗生素或益生菌；飲食習慣特殊者，例如素食者。

1.4 材料

1.4.1 主要儀器 移液器(Eppendorf N13462C Eppendorf)；小型離心機[ABSON MiFly-6，合肥艾本森科學儀器有限公司(中國)]；PCR儀[ABI GeneAmp?9700型，ABI(美國)]；測序儀[Illumina Miseq，Illumina(美國)]等。

1.4.2 試劑 涼血解毒方(茵陳30 g、梔子15 g、生地15 g、生黃芪15 g、赤芍30 g、丹參15 g、丹皮15 g、升麻15 g、白術15 g、茯苓15 g、黃芩15 g，批號：190631-1，北京康仁堂藥業(yè)有限公司訂購免煎顆粒劑)；DNA抽提試劑盒[E.Z.N.A.?Soil DNA Kit，Omega Bio-Tek(美國)]；建庫試劑盒[NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit，Bioo Scientific(美國)]；測序試劑盒[MiSeq Reagent Kit v3，Illumina(美國)]等。YCFA培養(yǎng)基(酪胨10 g/L，酵母提取物2.5 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8 g/L，血紅素0.05 g/L，NaCl 4.5 g/L，CaCl2·6H2O 0.09 g/L，KH2PO40.45 g/L，K2HPO40.45 g/L，MgSO4·7H2O 0.09 g/L)。

1.5 研究方法和步驟

1.5.1 糞便樣本的采集和處理 收集新鮮糞便，30 min內送到實驗室，立即置于超凈工作臺進行處理，挑取中心部位糞便樣本(防止外源細菌污染以及腸壁細胞干擾)2 mL短時間內進行體外模擬發(fā)酵實驗。

1.5.2 涼血解毒方對HBV-ACLF患者腸道菌群干預的體外模擬發(fā)酵實驗

1.5.2.1 取樣、接種與厭氧培養(yǎng) 本研究嚴格按照上述納排標準收集了HBV-ACLF患者的新鮮糞便樣本，樣本采集后短時間內置于超凈臺并分取4份，每份約0.5 g，然后加入到含0、10%、50%、100%中藥的培養(yǎng)基(表1)中混勻，立即放置在厭氧罐中厭氧培養(yǎng)24 h。

表1 含有不同涼血解毒方濃度的培養(yǎng)基配方

1.5.2.2 培養(yǎng)后樣本處理 (1)過濾：將無菌漏斗置于50 mL離心管上，用無菌紗布將培養(yǎng)好的糞便菌液進行過濾以濾除糞便沉渣。(2)保菌：取1 mL菌液加入含有500 μL甘油(50%)的離心管中，混勻，-80 ℃凍存。(3)離心：高速離心機離心(12 000 r/min，15 min)，分裝上清和沉菌，-80 ℃凍存。

1.5.3 糞便及發(fā)酵沉菌的DNA提取 采用QIAamp DNA Mini Kit，具體按照試劑說明書進行操作。

1.5.4 糞菌群16S rDNA 測序分析 本研究所涉及的Illumina平臺MiSeq高通量測序由海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。

1.5.5 生物信息學分析 (1)測序數(shù)據(jù)處理；(2)操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類；(3)分類學分析；(4)多樣性分析；(5)樣本層次聚類分析；(6)微生物多元變量統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 一般資料 共納入HBV-ACLF患者10例，其中HBV-ACLF用藥組5例，未用藥組5例；健康志愿者15例。HP組與HBV-ACLF組的基本信息見表2。兩組年齡、BMI比較差異均無統(tǒng)計學意義(t值分別為2.110、4.256，P值均>0.05)。

表2 兩組研究對象的一般資料

2.2 測序數(shù)據(jù) 本研究共收集25個樣本，質控之后的空白clean tags數(shù)據(jù)量分布在38 009～41 802，clean tags經過去除嵌合體得到有效數(shù)據(jù)valid tags(即最終用于分析的數(shù)據(jù))數(shù)據(jù)量分布在32 184～37 043，valid tags平均長度分布在409.92～432.39 bp，各樣本OTU個數(shù)分布在300～536。每個樣本的tags信息見表3。

表3 每個樣本信息表

2.3 HBV-ACLF未用藥組與HP組腸道菌群多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性 結果顯示，HBV-ACLF患者腸道中微生物物種的豐富度降低，菌群多樣性降低。(1)衡量菌群豐度的Chao指數(shù)：HBV-ACLF未用藥組的Chao指數(shù)顯著低于HP組[587.5(575.0～625.0) vs623.5(524.0～673.5)，Z=3.876，P=0.036](圖1a)。(2)衡量群落多樣性的Shannon指數(shù)：HBV-ACLF未用藥組的Shannon指數(shù)顯著低于HP組[4.00(3.52～4.23) vs 4.62(4.24～5.13)，Z=2.876，P=0.028](圖1b)。(3)衡量菌群多樣性的Simpson指數(shù)：HBV-ACLF未用藥組的Simpson指數(shù)顯著低于HP組[0.84(0.78～0.88) vs 0.90(0.87～0.94)，Z=3.563，P=0.049](圖1c)。

注：a，Chao指數(shù)；b，Shannon指數(shù)；c，Simpson指數(shù)。

2.3.2 物種累積曲線 物種累積曲線顯示，隨著樣本量的增加，曲線趨于平緩，表明該研究中的物種并不會隨樣本量的增加而顯著增多，測序樣本量足以反映樣本中的絕大多數(shù)微生物信息(圖2)。

圖2 物種累積曲線

2.4 HBV-ACLF未用藥組與HP組菌群比較 HBV-ACLF未用藥組與HP組之間各個分類水平均存在一定的差異，運用OTU進行分析，可反映在門、綱、目、種、屬等各分類水平上各樣本的物種分類情況。在門水平，采用t檢驗，兩組之間存在3種菌群差異[擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)]；采用Wilcoxon檢驗，兩組之間存在2種菌群差異[擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)]；尤其在屬水平，采用Wilcoxon檢驗，兩組之間存在77種菌群差異。具體差異物種統(tǒng)計匯總見表4。

表4 各個水平菌群比較

根據(jù)OTU分析，在門分類水平和屬分類水平上通過柱狀圖反映腸道菌種情況，可以呈現(xiàn)不同物種在每例患者所占的比例以及兩組不同的菌種。結果顯示，HP組每個樣本均以擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為主，HBV-ACLF未用藥組擬桿菌門(Bacteroidetes)明顯減少，梭桿菌門(Fusobacterio)、變形菌門(Proteobacteria)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)增多(圖3)。HBV-ACLF未用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、布勞特菌屬(Blautia)、真桿菌屬(Eubacterium)較HP組明顯減少，而副桿菌屬(Parabacteroides)、乳酸桿菌(Lactobacllus)、梭桿菌(Fusobacterio)、鏈球菌(Streptococcus)較HP組增多(圖4)。

注：a，不同門分類在每個病例中所占的比例；b，HBV-ACLF未用藥組和HP組3種門分類的比較。Actinobacteris，放線桿菌門；Epsilonbacteraeota，表皮菌門；Tenericutes，馬鞭菌門；Gemmatimonadetes，芽單孢菌門；Cynobacteria，嗜肺桿菌門；Acidobacteria，酸桿菌門；Nitrospirae，硝基繡線菌門；Spirochaetes，螺旋體菌門；Deferribacteres，脫鐵桿菌門；Laescibacteria，不動桿菌門；Fibrobacteres，纖維桿菌門；Fusobacterio，梭桿菌門；Proteobacteria，變形菌門。

注：Eubacterium coprostanoligenes，糞甾烷內酯真桿菌屬；Eubacterium hallii-group，真桿菌屬；Agathobacter，陰溝桿菌屬； Agathobacter Blautla，布勞特菌屬；Fusobacterium，梭桿菌屬；Lactobacllus，乳酸桿菌；Parabacteroides，副桿菌屬；Ruminococcus，瘤胃菌；Streptococcus鏈球菌屬；uncultured-bacterium,未增養(yǎng)菌。

2.5 腸道菌群聚類分析 聚類分析結果整體趨勢表現(xiàn)為病種相同的研究對象大致聚類到一起，提示病種相同者腸道菌群構成相似，即HBV-ACLF患者腸道菌群構成相似，HP組腸道菌群構成相似(圖5)。

注：a，整體趨勢；b，聚類分析。

2.6 涼血解毒方對HBV-ACLF患者腸道菌群多樣性的影響 采用Shannon指數(shù)衡量HBV-ACLF患者腸道菌群多樣性。結果顯示，HBV-ACLF用藥組(涼血解毒方含藥濃度10%、50%、100%)Shannon指數(shù)[5.00(4.80～5.20)、5.30(4.78～6.12)、5.50(4.86～6.28)]較HBV-ACLF未用藥組[3.80(3.00～4.12)]顯著升高(Z值分別為2.443、3.374、3.235，P值分別為0.013、0.039、0.018)，且隨著含藥濃度升高，Shannon指數(shù)逐漸升高，表明涼血解毒方能夠恢復HBV-ACLF患者腸道菌群的多樣性，且含藥濃度越高，效果越明顯(圖6)。

圖6 不同濃度涼血解毒方對腸道菌群Alpha多樣性的影響

2.7 涼血解毒方對差異性菌屬的影響 為了解涼血解毒方對HBV-ACLF患者腸道菌群構成的影響，從屬分類水平進行了比較分析，結果顯示：HBV-ACLF用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)相對豐度值較HBV-ACLF未用藥組顯著升高(圖7b、d、f、h)，而梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)較未用藥組顯著降低(圖7j、l)(P值均<0.05)。

與HP組相比，HBV-ACLF未用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)相對豐度值明顯降低(圖7a、c、e、g)，梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)相對豐度值明顯升高(圖7i、k)(P值均<0.05)。

3 討論

ACLF是在慢性肝病基礎上，引起短期內急性或者亞急性肝功能失代償?shù)呐R床癥候群，病情危重，短期病死率極高，預后差[8]。目前關于ACLF的病理機制尚不清楚，但近幾年越來越多研究表明腸道細菌易位是引起ACLF很重要的原因[9]。然而目前缺乏ACLF患者腸道菌群相關的研究。

本研究運用16S rDNA通量測序法對HBV-ACLF患者和健康人群的腸道菌群進行測序分析，結果顯示兩組人群中腸道菌群具有顯著差異。腸道菌群的多樣性和豐度是衡量腸道菌群是否平衡的重要指標[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，衡量患者腸道菌群豐度的Chao指數(shù)在HBV-ACLF患者中顯著降低；衡量多樣性的Shannon指數(shù)在HBV-ACLF患者中顯著降低。進一步分析腸道菌群門、屬水平的分類學特征性改變，發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF患者與健康人群有顯著差異。HBV-ACLF未用藥組腸道菌群發(fā)生了廣泛的群落改變。大量潛在致病菌如副桿菌屬(Parabacteroides)、乳酸桿菌(Lactobacllus)、梭桿菌(Fusobacterio)、鏈球菌(Streptococcus)等在HBV-ACLF患者中顯著升高。

注：a、c、e、g、i、k，HP組與HBV-ACLF未用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)、梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)菌群變化；b、d、f、h、j、l，HBV-ACLF不同涼血解毒方含藥濃度瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)、梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)菌群變化。

本研究還觀察到HBV-ACLF患者較健康人群中相對豐度降低的菌屬，如瘤胃菌(Ruminococus)、真桿菌屬(Eubacterium)，其中，瘤胃球菌屬是已知的產生短鏈脂肪酸的細菌[11]。短鏈脂肪酸能夠發(fā)揮保護腸道的作用，其保護機制可能與促進腸道絨毛的生長修復，為腸道黏膜提供營養(yǎng)，增強腸道免疫以及促進微生物生長，抑制致病菌相關[12-13]。

本研究采用體外模擬發(fā)酵實驗，進一步分析了涼血解毒方對HBV-ACLF患者腸道菌群構成的影響，結果發(fā)現(xiàn)：HBV-ACLF用藥組瘤胃菌(Ruminococus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、擬桿菌(Bacteroidetes)、氏菌屬(Genusgenus)較未用藥組顯著升高，而梭桿菌(Fusobacterio)、變形菌(Proteobacteria)較未用藥組顯著減少(P值均<0.05)。研究結果表明，涼血解毒方能有效增加腸道優(yōu)勢菌，減少致病菌，從而恢復腸道正常菌群生物多樣性及豐度。毛螺菌、氏菌屬亦屬于短鏈脂肪酸細菌，同樣具有修復腸道黏膜的作用[14]。本研究中HBV-ACLF組兩種菌屬豐度顯著降低，涼血解毒方干預后明顯增多。擬桿菌[15]是人體腸道內常見的健康菌群之一，具有分解碳水化合物的作用，其減少可引起腸道消化不良。本研究中發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF組患者擬桿菌明顯減少，應用涼血解毒方干預后，擬桿菌明顯增加，由此推測，涼血解毒方改善臨床癥狀的作用機制可能與調節(jié)腸道內擬桿菌水平相關。此外，本研究應用涼血解毒方干預后，HBV-ACLF用藥組較未用藥組梭桿菌屬及變形菌屬顯著減少，提示減少致病菌，從而有效降低炎癥反應，可能是涼血解毒方作用機制之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF患者腸道菌群較正常健康人群腸道菌群結構豐度及多樣性顯著下降；HBV-ACLF患者腸道菌群區(qū)別于正常人群，表現(xiàn)為潛在致病菌異常升高，潛在有益菌異常降低，二者倒置導致腸道菌群紊亂；紊亂的腸道菌群可能通過細菌易位增加感染風險、炎癥過度活化，故在HBV-ACLF發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。進一步體外模擬發(fā)酵實驗結果表明，涼血解毒方能有效增加優(yōu)勢菌，減少致病菌，從而達到調節(jié)腸道菌群紊亂的作用，為進一步研究涼血解毒方治療HBV-ACLF的作用機制奠定基礎。

倫理學聲明：本研究方案于2018年10月29日經由北京地壇醫(yī)院倫理委員會審批，批號：2018第(036)-01號，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：侯藝鑫、張群負責課題設計，資料分析，撰寫論文；江宇泳、于浩、楊玉英參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；王憲波負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。