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    納米通道適配體傳感器對(duì)馬拉硫磷的檢測(cè)

    2022-06-23 02:09:30董曉婭王旭銳黃華杰王雪安
    關(guān)鍵詞:納米管孵育離子

    董曉婭,王旭銳,黃華杰,王雪安

    (江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植保工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

    農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中,農(nóng)藥過度使用不僅污染農(nóng)業(yè)水土環(huán)境,嚴(yán)重影響糧食安全,而且可能造成環(huán)境污染,影響人類健康.因此,快速檢測(cè)環(huán)境中農(nóng)藥的殘留一直是全球密切關(guān)注的熱點(diǎn)[1].作為一種高效廣譜殺蟲殺螨劑,有機(jī)磷農(nóng)藥馬拉硫磷(Mal)被廣泛用于水稻、小麥、棉花等作物害蟲的防治.但由于Mal具有抑制神經(jīng)遞質(zhì)的毒性,可通過皮膚或黏膜接觸、吸入或誤食而引起人體中毒[2],所以需要開發(fā)快速靈敏的檢測(cè)方法,以更好地保障人民群眾身體健康.

    目前對(duì)馬拉硫磷檢測(cè)的方法主要有色譜法[3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]、熒光方法[5]等.這些方法需要大型的專用儀器、熟練的技術(shù)人員,檢測(cè)成本較高.電化學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏度高、速度快、儀器價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[6].目前電化學(xué)方法檢測(cè)Mal的報(bào)道中,多使用制備過程復(fù)雜的納米復(fù)合物對(duì)傳感界面進(jìn)行修飾[7],不便于Mal的快速檢測(cè).因此,納米通道從快速簡(jiǎn)便、低成本進(jìn)行檢測(cè)的角度考慮,需要開發(fā)一種新的檢測(cè)方法.

    納米通道由于其結(jié)構(gòu)的尺寸效應(yīng)、比表面積效應(yīng)和納米管內(nèi)外的特殊物理化學(xué)性質(zhì),以及尺寸可控、易制備等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于納米電化學(xué)[8]和生物傳感[9]等領(lǐng)域.整流現(xiàn)象是納米通道的一個(gè)重要特征,其表現(xiàn)為在對(duì)稱的輸入電勢(shì)作用下,輸出不對(duì)稱的電流,即在工作電極、參比電極/對(duì)電極所施加的外加電場(chǎng)的作用下,緩沖液中的K+和Cl-等離子產(chǎn)生定向運(yùn)動(dòng).當(dāng)工作電極施加負(fù)電壓,正離子(K+)通過納米通道向工作電極移動(dòng)時(shí),受到納米通道內(nèi)靜電場(chǎng)的吸引而快速通過,形成較大的離子電流;當(dāng)工作電極施加正電壓,負(fù)離子(Cl-)通過納米通道向工作電極移動(dòng)時(shí),受到靜電場(chǎng)的排斥而緩慢通過,形成較小的離子電流.當(dāng)溶液中的帶電離子通過納米通道時(shí),與納米通道表面所修飾的基團(tuán)發(fā)生相互作用,引起納米通道中的電信號(hào)顯著變化,從而產(chǎn)生離子電流整流現(xiàn)象(ionic current rectification, ICR)[10].基于納米通道的整流現(xiàn)象,SA等[11]使用硅烷將二氫咪唑修飾到石英納米管的納米通道中檢測(cè)環(huán)境中的Co2+離子.

    文中通過在納米通道中引入可以特異性結(jié)合目標(biāo)物Mal的適配體,利用適配體與Mal結(jié)合后引起的納米通道離子電流整理現(xiàn)象,構(gòu)建可用于檢測(cè)Mal的納米通道適配體傳感器,以實(shí)現(xiàn)對(duì)Mal的檢測(cè).

    1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    利用納米管的整流現(xiàn)象和適配體特異結(jié)合目標(biāo)物的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了納米管適配體傳感器,如圖1所示.首先將適配體1(Apt-1)修飾到鍍有金膜的納米管上,當(dāng)適配體2(Apt-2)與Apt-1通過堿基互補(bǔ)配對(duì)相結(jié)合后,玻璃管納米通道表面由于堿基數(shù)量增加而攜帶有更多的負(fù)電荷,從而場(chǎng)強(qiáng)發(fā)生改變.由于Mal的存在,2條Mal適配體片段與Mal形成穩(wěn)定的Apt-1/Mal/Apt-2復(fù)合物結(jié)構(gòu),這使場(chǎng)強(qiáng)變化后的靜電場(chǎng)穩(wěn)定存在[12],并且Apt-1/Mal/Apt-2穩(wěn)定結(jié)構(gòu)中負(fù)電荷增多,增強(qiáng)了適配體傳感器納米通道中的靜電場(chǎng),從而影響檢測(cè)緩沖液中的K+和Cl-等離子的定向移動(dòng),發(fā)生整流現(xiàn)象;進(jìn)一步根據(jù)整流現(xiàn)象的離子電流,定量檢測(cè)Mal.

    圖1 納米通道適配體傳感器工作示意圖

    2 試驗(yàn)部分

    2.1 化學(xué)藥品和材料

    Mal(1.0×10-4g/mL)購(gòu)自安譜科技(中國(guó)上海).寡核苷酸鏈適配體(Apt-1,Apt-2)(ULTRA-PAGE級(jí))由生工生物科技有限公司(中國(guó)上海)合成和純化,其堿基序列見表1.三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris/HCl)、6-巰基-1-己醇(MCH)購(gòu)自安譜科技(中國(guó)上海).硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管(外徑1.0 mm,內(nèi)徑0.58 mm;長(zhǎng)10.0 cm)購(gòu)自SUTTER有限公司.

    表1 適配體序列

    適配體Apt-1和適配體Apt-2分別用1.0×10-2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制成濃度為1.0×10-4mol/L的溶液,在-20 ℃環(huán)境中儲(chǔ)存?zhèn)溆?所使用的化學(xué)試劑均為分析純.試驗(yàn)使用的超純水從MILLI-Q凈水系統(tǒng)獲取(25 ℃時(shí)電阻率大于18.2 MΩ/cm).

    2.2 納米管的制備

    將硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管放入微電極拉制儀(P-97,SUTTER公司)的拉桿中并夾緊,設(shè)置拉制參數(shù):HEAT=309,PULL=0,VELOCITY=40,TIME=200,將硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管的一端拉制成空心圓錐形,使其形成納米通道.

    2.3 納米通道內(nèi)鍍膜

    將拉制好的納米管固定在真空鍍膜儀(LEICA EM ACE600)的工作臺(tái)平面上,使其空心圓錐形納米通道正對(duì)熔融金屬的噴射方向,在工作參數(shù)為100 W的RF模式下鍍金120 s,使納米通道內(nèi)鍍上金膜,從而為固定適配體提供條件.

    2.4 Ag/AgCl電極的制作

    剪取2根長(zhǎng)15 cm的Ag絲(Φ0.3 mm),將Ag絲的一端浸入次氯酸HClO溶液中6 cm,室溫下靜置30 min,使銀絲表面被HClO充分氧化產(chǎn)生AgCl,從而制成Ag/AgCl電極.

    2.5 納米管適配體傳感器的構(gòu)建

    將-20 ℃環(huán)境下儲(chǔ)存的適配體Apt-1解凍,用pH為7.4的PBS(1.0×10-2mol/L)將其稀釋至1.0×10-6mol/L,之后與1.0×10-2mol/L TCEP溶液混合,Apt-1與TCEP的體積比為10∶1.在室溫下避光反應(yīng)1 h,以斷開適配體Apt-1溶液中的二硫鍵.

    使用微量移液器將鍍金納米管中注入去除二硫鍵后的Apt-1溶液,并確保溶液填充至納米管尖端部分.在4 ℃條件下放置16 h,使Apt-1 5′端修飾的巰基與納米通道內(nèi)的金膜通過金硫鍵結(jié)合,將Apt-1固定在納米通道內(nèi).洗去納米通道中的殘余溶液,向納米通道內(nèi)加入1.0×10-2mol/L的MCH溶液,室溫下靜置10 min,從而封閉納米通道上的活性位點(diǎn),最后清洗殘余溶液.

    2.6 離子電流信號(hào)的獲取

    使用緩沖液(含有5.0×10-2mol/L NaCl,1.0×10-2mol/L KCl,1.0×10-2mol/L MgCl2,5.0×10-2mol/L Tris/HCl,pH為8.0)將Mal稀釋至不同濃度,分別將不同濃度的Mal溶液和濃度為1.0×10-6mol/L的 Apt-2溶液混合后,加入修飾有Apt-1的納米通道中,在室溫下孵育40 min,使Mal與適配體Apt-1及Apt-2結(jié)合.最后將納米管中的殘余溶液吸出,并用緩沖液沖洗納米管的納米通道.

    取1根Ag/AgCl電極,將表面為AgCl的一端插入修飾有適配體Apt-1的納米通道中,并將此納米通道浸入檢測(cè)緩沖溶液中,檢測(cè)緩沖溶液為含有2.0×10-2mol/L的KCl和2.0×10-2mol/L的Tris/HCl(pH為8.0)的混合液.將Ag/AgCl電極的Ag端連接CHI電化學(xué)工作站(CHI440C,上海辰華儀器有限公司)的工作電極.取另1根Ag/AgCl電極,將表面為AgCl的一端浸入檢測(cè)緩沖液中,另一端連接CHI電化學(xué)工作站的參比電極和對(duì)電極的接線上,構(gòu)成檢測(cè)回路.使用CHI440C電化學(xué)工作站對(duì)檢測(cè)緩沖液中的離子電流信號(hào)進(jìn)行檢測(cè).檢測(cè)方法為線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry),設(shè)置運(yùn)行參數(shù):掃描電勢(shì)從-1.0 V到+1.0 V,掃描速率為100 mV/s,采樣頻率為60 kHz.使用CHI-440C軟件記錄電流-電壓曲線(I-E曲線),并使用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

    2.7 實(shí)際樣品的準(zhǔn)備

    取0.9 mL自來水,向其中分別加入0.1 mL濃度為1.0×10-6,2.0×10-6和5.0×10-6mol/L的Mal溶液,配制成Mal濃度分別為1.0×10-7,2.0×10-7和5.0×10-7mol/L的1 mL自來水樣.采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè).

    2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

    分別使用本傳感器和氣相色譜儀對(duì)水樣進(jìn)行檢測(cè).使用本傳感器檢測(cè)步驟參照上文第2.6節(jié).使用氣相色譜儀(Shimadzu 7AG,日本)定量測(cè)定自來水樣中的Mal時(shí),設(shè)置柱頭壓力為103.4 kPa,進(jìn)樣器溫度為250 ℃,進(jìn)樣器在不分流模式下運(yùn)行 2 min(采樣時(shí)間),使用氦氣作為流動(dòng)相.

    3 結(jié)果與討論

    3.1 材料表征

    納米管納米通道的幾何尺寸影響離子電流的大小.采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)表征拉制好的納米管尖端納米孔的幾何尺寸,表征圖如圖2所示.從圖中可以看出,所拉制好的納米管尖端內(nèi)徑為230 nm,這表明所拉制的納米管是納米通道.

    圖2 納米管的SEM圖

    圖3為材料的圓二色光譜(circular dichroism,CD)圖,用于表征適配體Apt-1,Apt-2和目標(biāo)物Mal孵育前后的結(jié)構(gòu)變化.圖中θ,λ分別為摩爾橢圓度、波長(zhǎng);曲線②是只有Apt-1和Apt-2片段的情況下的CD譜,曲線②在247 nm處出現(xiàn)波谷,在278 nm處出現(xiàn)波峰;曲線①為加入目標(biāo)Mal后的CD譜,從圖中可以看出,當(dāng)適配體溶液體系中加入目標(biāo)物Mal后,CD譜曲線中波谷發(fā)生了紅移,波谷強(qiáng)度增強(qiáng),而波峰發(fā)生了藍(lán)移,波峰強(qiáng)度增強(qiáng),這表明Mal與適配體結(jié)合,適配體寡核苷酸鏈的雙螺旋體發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化.

    圖3 材料CD譜

    3.2 可行性驗(yàn)證

    為考察傳感器對(duì)Mal檢測(cè)的可行性,研究了傳感器在不同情況下的離子電流響應(yīng).圖4為不同結(jié)合體系下的離子電流曲線,圖中i,E分別為電流、電勢(shì);曲線①為鍍金膜后的納米通道的離子電流曲線,可見相對(duì)于0 V時(shí),-1.0和+1.0 V處的電流分別增加了4.2×10-8和3.3×10-8A,這一電流不對(duì)稱性表現(xiàn)出了微弱的整流現(xiàn)象,這是由于納米通道內(nèi)壁靜電場(chǎng)強(qiáng)比較弱.曲線②,③和④分別為在納米通道的金膜上修飾Apt-1后、修飾Apt-1和Mal以及修飾Apt-1和Apt-2后的離子電流曲線,可以發(fā)現(xiàn)-1.0和+1.0 V處相比在0 V處的電流差值增大,即產(chǎn)生電流整流現(xiàn)象比較明顯.產(chǎn)生這一現(xiàn)象是由于納米通道內(nèi)修飾適配體后,適配體所帶的電荷可以形成有效的靜電場(chǎng),當(dāng)施加對(duì)稱電壓時(shí),在外加電場(chǎng)下,溶液中K+和Cl-離子產(chǎn)生定向運(yùn)動(dòng).當(dāng)施加負(fù)電壓時(shí),K+定向向工作電極移動(dòng),由于修飾在納米通道上的適配體帶負(fù)電荷,有助于K+通過納米通道,形成較大的電流;當(dāng)施加正電壓時(shí),Cl-定向向工作電極移動(dòng),由于修飾在納米通道上的適配體帶負(fù)電荷,阻礙Cl-的定向通過,產(chǎn)生較低的電流,從而產(chǎn)生了比較明顯的整流現(xiàn)象.曲線②,③和④在-1.0 V處的電流值相差不大,這是由于修飾Apt-1后,即使加入Mal,由于只有Apt-1時(shí),Apt-1不能與Mal結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu);當(dāng)在金膜上修飾Apt-1后,加入Apt-2,沒有目標(biāo)物Mal的存在,Apt-1與Apt-2同樣不能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu),因此三者的整流現(xiàn)象比較接近.

    圖4 不同結(jié)合體系下的離子電流曲線

    當(dāng)在修飾有Apt-1的納米通道中加入目標(biāo)物Mal和 Apt-2后,Apt-1與Mal和 Apt-2結(jié)合,形成Apt-1/Mal/Apt-2穩(wěn)定結(jié)構(gòu),負(fù)電荷增多,增強(qiáng)了納米管傳感器內(nèi)壁的靜電場(chǎng),進(jìn)而產(chǎn)生更強(qiáng)的整流現(xiàn)象,如圖4中曲線⑤所示.

    3.3 傳感器工作條件的優(yōu)化

    Apt-1的使用濃度影響其在納米管通道內(nèi)的修飾量,當(dāng)Apt-1在納米通道內(nèi)的固定量不足,則不能提供足夠與目標(biāo)結(jié)合的位點(diǎn),從而影響傳感器的性能.圖5為納米通道內(nèi)修飾不同濃度Apt-1(1.0×10-7,2.0×10-7,5.0×10-7,1.0×10-6,2.0×10-6,5.0×10-6mol/L)后,在濃度為1.0×10-6mol/L的Mal和1.0×10-6mol/L的Apt-2的混合溶液中孵育后,根據(jù)獲得的-1.0 V處的離子電流值所繪制的曲線,圖中i-1.0 V,CA-1分別為-1.0 V處的電流值、Apt-1溶液濃度.從圖中可以看出,隨著Apt-1的濃度增加,離子電流不斷增大,當(dāng)Apt-1濃度增到1.0×10-6mol/L時(shí),曲線趨于穩(wěn)定,電流不再有明顯增加.這是因?yàn)锳pt-1的濃度達(dá)到1.0×10-6mol/L時(shí),可以提供足夠的位點(diǎn)與目標(biāo)結(jié)合.

    圖5 不同濃度Apt-1對(duì)應(yīng)的-1.0 V處的電流值

    Apt-2的濃度影響Apt-1和Apt-2對(duì)目標(biāo)Mal的識(shí)別.使用濃度為1.0×10-6mol/L的Apt-1修飾納米通道,考察Apt-2的濃度對(duì)傳感器離子電流的影響.試驗(yàn)獲得-1.0 V處的離子電流值后繪制曲線如圖6所示,圖中CA-2為Apt-2溶液濃度.從圖中可以看出,隨著Apt-2濃度增大,離子電流增大,當(dāng)Apt-2的濃度為1.0×10-6mol/L時(shí),離子電流幾乎沒有增加.因此,在檢測(cè)Mal時(shí),Apt-2的濃度采用1.0×10-6mol/L.

    圖6 不同濃度Apt-2對(duì)應(yīng)的-1.0 V處的電流值

    孵育溶液的pH影響適配體與Mal之間氫鍵的形成,進(jìn)而影響Apt-1/Mal/Apt-2復(fù)合物的形成.因此需要對(duì)孵育溶液的pH值進(jìn)行考察.圖7為不同孵育條件下的離子電流曲線i-1.0 V,圖中t為孵育時(shí)間.

    圖7a為采用不同pH的孵育溶液所對(duì)應(yīng)的離子電流.從圖中可以看到,孵育溶液的pH為8.0時(shí),獲得了最大的離子電流i-1.0 V.因此,使用pH為8.0的孵育溶液.

    圖7 不同孵育條件下的離子電流曲線的i-1.0 V值

    孵育時(shí)間影響Apt-1/Mal/Apt-2復(fù)合物的形成,因此對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn).如圖7b所示,隨著孵育時(shí)間增大,i-1.0 V增大,但在孵育時(shí)間超過40 min后,獲得的i-1.0 V并沒有明顯的變化.因此,設(shè)置傳感器的孵育時(shí)間為40 min.

    3.4 線性范圍和檢測(cè)限

    為了考察傳感器對(duì)Mal定量檢測(cè)的能力,對(duì)不同濃度Mal進(jìn)行檢測(cè),如圖8所示.

    圖8 檢測(cè)不同濃度Mal的i-E曲線(插圖:i-1.0 V-lg CMal擬合曲線)

    在馬拉硫磷溶液濃度CMal為1.0×10-8~1.0×10-6mol/L時(shí),可獲得Mal濃度對(duì)數(shù)和i-1.0 V之間的函數(shù)關(guān)系為

    i-1.0 V=8.81lgCMal-681.87,R2=0.972 0.

    (1)

    傳感器對(duì)Mal的檢測(cè)限LOD為3.33×10-9mol/L.

    表2為不同電化學(xué)適配體傳感器對(duì)Mal檢測(cè)方法的對(duì)比,表中LDR為線性檢測(cè)范圍.研究中的納米通道適配體傳感器的檢測(cè)限低于基于Au納米顆粒[13]、修飾精胺的Ag納米顆粒[14]和液晶材料[15]的適配體傳感器,同時(shí)具有更寬的線性檢測(cè)范圍.與基于由帶負(fù)電荷的上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子和陽(yáng)離子聚合物封裝的金納米粒子制作的復(fù)合材料的傳感器[5]相比,文中傳感器的基體材料的制備過程更加簡(jiǎn)單.

    表2 檢測(cè)Mal的方法比較

    3.5 傳感器的選擇性和穩(wěn)定性

    圖9為傳感器的選擇性和穩(wěn)定性,圖中|i-i0|和n分別為電流差值、試驗(yàn)組別.

    圖9 傳感器的選擇性和穩(wěn)定性

    傳感器的選擇性是考察傳感器性能的重要指標(biāo).使用該傳感器分別檢測(cè)二嗪磷(Dia)、三唑磷(Trz)、氯吡硫磷(Chl)和Mal,所有農(nóng)藥濃度均為1.0×10-6mol/L.檢測(cè)結(jié)果如圖9a所示,傳感器檢測(cè)Mal時(shí)獲得的-1.0 V處電流差值|i-i0|遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他3種農(nóng)藥,其中i0表示檢測(cè)體系中只有Apt-1和Apt-2而沒有農(nóng)藥時(shí)-1.0 V處的電流值.這表示所設(shè)計(jì)的納米管適配體傳感器對(duì)于檢測(cè)Mal具有較高的選擇性.

    穩(wěn)定性是傳感器性能的重要指標(biāo).設(shè)置5組重復(fù)試驗(yàn),每組試驗(yàn)測(cè)定3次.試驗(yàn)結(jié)果如圖9b所示,組內(nèi)最大變異系數(shù)為2.05%,組間變異系數(shù)為0.33%.這表明所設(shè)計(jì)的納米通道適配體傳感器用于檢測(cè)Mal時(shí)具有較高的穩(wěn)定性.

    3.6 實(shí)樣檢測(cè)

    為了考察納米管適配體傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的可用性,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定.表3為自來水中的Mal分析(試驗(yàn)次數(shù)n=3),表中C+為添加Mal的濃度,GC為使用氣相色譜法對(duì)水樣中Mal濃度的檢測(cè)結(jié)果,Ct為該傳感器對(duì)Mal濃度檢測(cè)結(jié)果,r為回收率,RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.如表所示,水樣中加入Mal的回收率為96.60%~101.00%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.39%~6.02%.使用氣相色譜法檢測(cè)制備的水樣,所得結(jié)果與使用納米管適配體傳感器所得檢測(cè)結(jié)果相比較,兩者基本一致,這表明所構(gòu)建的傳感器可應(yīng)用于檢測(cè)實(shí)際樣品中的Mal.

    表3 自來水中的Mal分析(n=3)

    4 結(jié) 論

    1)根據(jù)納米通道信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所產(chǎn)生的離子電流整流現(xiàn)象,使用玻璃管作為基體,通過在玻璃管的納米通道表面修飾適配體,成功地構(gòu)建了可用于檢測(cè)Mal的納米通道適配體傳感器.

    2)該傳感器檢測(cè)Mal的線性范圍為1.0×10-8~1.0×10-6mol/L,靈敏度高,選擇性好,并成功用于水樣中Mal的檢測(cè),有望替代檢測(cè)成本高昂、需要使用大型專用儀器的傳統(tǒng)檢測(cè)方法,為靈敏檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的發(fā)展開辟了新的途徑.

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