再生水景觀利用對斑馬魚(Danio rerio)下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸相關基因轉錄水平的影響

葉婷, 楊瑞泉, 李艷玲, 田密, 張翔, 楊大星, 李燦

貴陽學院生物與環(huán)境工程學院/貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲重點實驗室,貴陽 550005

在全球水資源短缺及水污染狀況下,再生水回用是解決水資源供需矛盾的有前景的策略。 目前,再生水已經廣泛用于工業(yè)冷卻、城市街道清洗、城市綠化植被澆灌、景觀水體補給及農業(yè)灌溉等。 多項研究表明,盡管廢水處理技術正不斷改善,但現(xiàn)有的污水處理設施并不能完全去除污水中的內分泌干擾化合物。 因此,再生水中存在多種微量內分泌干擾化合物,國內外很多污水處理廠排出的再生水中都相繼檢出辛基苯酚、壬基酚、雙酚A 和鄰苯二甲酸二丁酯等內分泌干擾化合物[1-3]。 Zhang 等[4]研究發(fā)現(xiàn)再生水中存在具有肝臟X 受體(liver X receptorα,LXRα)-激動劑/拮抗劑活性的內分泌干擾化合物。研究表明將再生水用于飲用水、農業(yè)灌溉和水產養(yǎng)殖影響了人類健康[5]。 為了維持野生生物生境,再生水回用于河湖溪流等景觀水體以及濕地恢復對水體環(huán)境造成了影響[6]。 由于再生水中內分泌干擾化合物的存在,再生水回用于水體補給會對水體生物產生潛在健康危害。 但很少有研究關注再生水回用對水體生物產生的健康危害。

關于水體安全評價方法有傳統(tǒng)的化學分析方法和生物毒性測試法[7],并且生物毒性測試法已成功應用于廢水處理過程中毒性效應的去除研究中[8]。再生水中內分泌干擾化合物是多種、微量及混合存在的。 內分泌干擾化合物在微量時就能引起內分泌干擾效應,并且多種微量污染物共同存在時具有潛在的聯(lián)合毒性作用[9]。 而傳統(tǒng)的化學分析法只是測定再生水中內分泌干擾化合物的種類及濃度,不能對多種微量內分泌干擾化合物的聯(lián)合毒性進行評價。 對再生水的水質評價不能只局限于傳統(tǒng)的化學分析方法,采用生物毒性測試法評價再生水的安全性更加準確。 傳統(tǒng)的水生態(tài)毒性測試主要是使用魚類、水蚤和藻類作為測試物種,并對其傳統(tǒng)指標如生長速率、繁殖和存活狀況進行評估。 然而環(huán)境污染物在細胞、組織、個體、種群、群落甚至生態(tài)系統(tǒng)等不同水平上的毒害作用均始于污染物的分子作用效應,分子效應是生態(tài)毒理效應中最早期、最靈敏的效應。 基于分子毒理效應的生物毒性測試法已逐漸用于評價再生水的安全性。 如再生水對人胚腎細胞毒性研究顯示,再生水在細胞水平上降低細胞增殖率、增加細胞損傷率并誘導了細胞凋亡,分子水平上影響了細胞周期調節(jié)蛋白(p16INK4a、p27Kip1、細胞依賴性激酶2 和4、細胞周期蛋白D1 和E)和凋亡相關調節(jié)蛋白(p-JNK、Bcl-2 和 caspase-3)的表達[10]。 再生水對搖蚊幼蟲(Chironomus riparius)暴露21 d 顯著影響了分子水平上內分泌相關基因和細胞應激基因卵黃蛋白原(vitellogenin,Vtg)、熱應激蛋白(heat shock protein 70,hsp70)、熱應激同源蛋白(heat-shock cognate protein 70,hsc70)的表達,而不改變個體水平指標如發(fā)育率、繁殖率和孵化率[11]。 再生水對蝸牛(Physa acuta)暴露21 d 降低了蝸牛的生殖力,而生殖力和內分泌相關核受體維甲酸X 受體(retinoid X receptor, RXR)相關[12]。 再生水誘導了雄性斑馬魚Vtg的表達,干擾了斑馬魚體內睪酮(testosterone, T)和雌二醇(17α-estradiol, E2)的合成[2]。 因此再生水對水體生物具有生殖內分泌干擾毒性,但具體的分子機制還需要進一步研究。

斑馬魚作為模式生物已經廣泛應用于環(huán)境毒理學領域研究中。 斑馬魚與人類具有高度相似的基因及生理學特征,斑馬魚與人類的內分泌系統(tǒng)相似,因此,關于環(huán)境污染物對斑馬魚的毒理研究結果可以類推到對人類的影響上。 近十幾年來,斑馬魚廣泛應用于研究環(huán)境污染物的內分泌干擾及生殖毒性效應[13-14]。 因此,為了評價再生水的內分泌干擾效應分子機制,本研究選擇斑馬魚作為測試物種,研究結果對分析再生水對人類健康的影響具有一定的意義。 魚類的生殖受到下丘腦-垂體-性腺(hypothalamus-pituitary-gonadal, HPG)軸的調控[15],即下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, Gnrh),促進腦垂體分泌促卵泡素(follicle stimulating hormone, Fsh)和促黃體生成素(luteinizing hormone, Lh)。 Fsh 和 Lh 釋放后迅速進入魚類血液循環(huán)系統(tǒng),與對應的受體促卵泡素受體(follicle stimulating hormone receptor, Fshr)和促黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor, Lhr)識別并結合,然后以復合體的方式進入性腺(精巢或卵巢),調控下游類固醇激素合成通路相關基因表達,進一步調控性腺分泌T 和E2 以及配子的生長發(fā)育。 斑馬魚內分泌系統(tǒng)HPG 軸已經被廣泛用于水體環(huán)境生態(tài)毒理研究中,用于評價生殖內分泌干擾效應并揭示潛在分子機制[16-17]。 如 Maharajan 等[17]采用斑馬魚HPG 軸研究了吡咯氧芬可通過改變HPG 軸基因表達,引起斑馬魚生殖內分泌穩(wěn)態(tài)和性腺組織病理學的損害。 一些研究學者采用斑馬魚HPG 軸研究了銅引起斑馬魚生殖內分泌干擾的分子機制[18]。 所以本研究選用斑馬魚HPG 軸相關基因轉錄水平分析再生水對水體生物的內分泌干擾分子毒理效應。

本研究以貴陽市某再生水廠出水為研究對象,利用模式生物斑馬魚作為生物檢測材料,將成年健康的雌性和雄性斑馬魚直接暴露于再生水中7 d,為了分析斑馬魚在再生水中是否會產生適應或修復機制,暴露時間又延長7 d(14 d),采用熒光定量多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術分析再生水對斑馬魚HPG 軸相關基因表達的影響,研究再生水對成年斑馬魚的內分泌干擾分子效應,即分析斑馬魚腦受體信號途徑基因,包括雄激素受體(androgen receptor,Ar)和雌激素受體1(estrogen receptor 1,Esr1);下丘腦和垂體激素相關基因,包括促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone 2,Gnrh2)、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone 3,Gnrh3)、卵泡刺激素β多肽(follicle stimulating hormone beta polypeptide,Fshb)和黃體生成素β多肽(luteinizing hormone beta polypeptide,Lhb);性腺類固醇途徑相關基因,包括Ar、Esr1、孕激素受體(progesterone receptor,pgr)、類固醇源性急性調節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory,star)、細胞色素P450 介導的側鏈裂解酶(cytochrome P450-mediated side-chain cleavage enzyme,cyp11a1)、11β-羥化酶(11β-hydroxylase,cyp11b)、細胞色素 P450 芳香化酶 17(c17α-hydroxylase/17-20 lyase,cyp17)、卵巢芳香化酶 ( ovarian cytochrome P450 aromatase,cyp19ala)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,hsd3b)、11β-羥化類固醇脫氫酶 2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,hsd11b2)、17β-羥化類固醇脫氫酶3(17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 3,hsd17b3)和 20β-羥化類固醇脫氫酶(20β-hydroxysteroid dehydrogenase,hsd20b),通過分析再生水對以上HPG 軸相關基因表達水平的影響,對再生水的生態(tài)影響做出預測或早期警報,提示是否有生態(tài)風險發(fā)生的可能。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗組再生水采自貴陽市某再生水廠再生水工藝出水,再生水系統(tǒng)采用“超濾膜+反滲透”雙膜法處理工藝將二級工藝出水進行深度處理后得到再生水,再生水主要回用于公園水體及河道補給。 再生水取樣后立即運輸?shù)綄嶒炇疫M行斑馬魚暴露實驗。空白對照組水樣為充分曝氣脫氯后的自來水。

野生型斑馬魚購自上海費曦生物科技有限公司,飼養(yǎng)于人工氣候箱中,溫度為(28±0.5) ℃,飼養(yǎng)用水為充分曝氣脫氯后的自來水,每天定時喂以飼料2 次,飼料為Zeigler AP100 成魚專用飼料。 暴露實驗開展前馴化培養(yǎng)1 周,每日換水,篩選健康活潑的斑馬魚進行后續(xù)實驗。

1.2 儀器與試劑

儀器:SW-CJ-1FD 超凈工作臺(上海博迅,中國);Microfuge 20R 臺式(常溫/低溫)離心機(美國貝克曼庫爾特公司);NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司);T100TMThermal Cycler 梯度 PCR 儀(美國 BIO-RAD 公司),CFX96TMReal Time System 實時定量 PCR 儀(美國 BIO-RAD公司);超純凈水系統(tǒng)(中國艾柯AKDL-Ⅱ定量分析型超純水機)。

試劑:RNA 提取試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司,中國);反轉錄試劑盒(EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix,北京全式金生物技術有限公司,中國);PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 試劑盒(北京全式金生物技術有限公司,中國)。

1.3 再生水對斑馬魚的暴露試驗

將斑馬魚分別靜態(tài)暴露于充分脫氯自來水(對照組,C 組)和再生水(實驗組,RW)中,每個處理設置3個重復。 每個重復組含有30 尾斑馬魚,雌雄比為1∶1,飼養(yǎng)于人工氣候箱中,溫度為(28±0.5) ℃,每天光照 ∶黑暗時間為14 h ∶10 h,每天定時喂以飼料2次,暴露液每天更換一次,記錄斑馬魚死亡數(shù)量并及時清除死魚(斑馬魚無任何反應即確認死亡),分別暴露7 d 和14 d,預實驗結果顯示暴露7 d 對HPG軸基因轉錄水平有影響,為了分析延長再生水暴露時間后,斑馬魚是否會在分子水平產生適應或修復機制,所以又延長暴露7 d (14 d),在暴露期間,每天記錄魚的死亡率。 分別暴露7 d 和14 d 后,隨機取魚置于冰上麻醉后測量魚的全長(total body length,Tbl)和濕質量(wet weight, ww),并計算生長狀況因子(condition factor,K)。

式中:wt 為魚的濕質量(g),Tbl 為魚的全長(cm)。

解剖分離腦、精巢和卵巢稱量并存于-80 ℃?zhèn)溆?用于組織RNA 的提取和實時定量 PCR(qRTPCR)檢測,并計算腦指數(shù)(brain-somatic index, BSI)和性腺指數(shù)(gonadosomatic index, GSI)。

式中:wt 為魚的濕質量(g),bw 為魚的腦質量(brain weight, bw),單位為g。

式中:gw 為魚的性腺質量(gonad weight, gw),單位為g。

1.4 RT-PCR

取斑馬魚腦、精巢和卵巢組織分別倒入盛有液氮的研缽中,用一次性研磨棒充分研成粉末,參照RNA 提取試劑盒說明書提取各組織的總RNA,并取RNA 進行凝膠電泳檢測和核酸濃度儀檢測。 按照實際和說明書操作,以RNA 為模板將RNA 反轉錄成cDNA 鏈。 采用實時定量PCR 技術檢測斑馬魚HPG 軸相關基因的相對表達量。 用于熒光定量PCR 的引物序列參考前人研究[19],如表1 所示。 反應體系為 20 μL:GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL、cDNA 模板 1 μL、Nuclease-free Water 7 μL 和上下游引物各1 μL。 反應在 CFX96TM Real-Time System 實時定量PCR 儀中進行,反應條件為:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán);最后在60 ~95 ℃進行熔解曲線分析。 選擇表達相對穩(wěn)定的β-actin作為內參基因,利用2-△△CT方法計算基因的相對表達量[20]。

表1 用于實時熒光定量PCR 分析的引物序列Table 1 Primers used in the real-time quantitative PCR analysis

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的數(shù)據(jù)結果均表示為平均值±標準誤差(Mean±SEM)。 實驗結果中所有圖片均用軟件SigmaPlot 10.0 繪制。 采用SPSS16.0 軟件進行均值比較及t檢驗。P＜0.05、P＜0.01 時差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 再生水對斑馬魚生長發(fā)育參數(shù)的影響

在7 d 和14 d 的暴露期間,所有處理組的實驗魚均沒有死亡。 再生水處理對斑馬魚體長、體質量、生長狀況因子、腦指數(shù)及性腺指數(shù)的影響如表2 所示。 由表2 可知,再生水對斑馬魚暴露14 d 對生長發(fā)育參數(shù)如體長、體質量、生長狀況指數(shù)、腦指數(shù)及性腺指數(shù)無顯著影響,再生水處理降低了雄性斑馬魚的腦指數(shù)和性腺指數(shù),但不顯著(P＞0.05)。 類似地,再生水也降低了雌性斑馬魚的性腺指數(shù),但沒有顯著性(P＞0.05)。

表2 再生水對斑馬魚生長發(fā)育參數(shù)及器官指數(shù)的影響Table 2 Effects of reclaimed water on the growth and development parameters and organ index of zebrafish

2.2 再生水暴露7 d 對斑馬魚HPG 軸相關基因轉錄水平的影響

再生水對斑馬魚暴露7 d 后受體信號途徑、下丘腦和垂體激素相關基因的轉錄水平變化如圖1 所示。 由圖1 可知,再生水對斑馬魚暴露7 d 后,成年雄性斑馬魚腦雄激素受體Ar、Fshb、Lhb和Gnrh2基因的轉錄水平顯著降低(P＜0.05),成年雄性斑馬魚腦Esr1和Gnrh3基因的轉錄水平顯著下降(P＜0.01);與雄性斑馬魚不同,再生水對雌性斑馬魚腦Ar、Esr1、Fshb、Lhb和Gnrh2表達水平無顯著影響(P＞0.05),再生水顯著上調了腦Gnrh3轉錄水平(P＜0.01)。 圖2 和圖3 展示了斑馬魚暴露于再生水7 d后斑馬魚性腺類固醇途徑相關基因轉錄水平變化。由圖2 和圖3 可知,再生水對斑馬魚暴露7 d 后,成年雄性斑馬魚睪丸受體信號途徑Ar基因的轉錄水平顯著減少(P＜0.05),雄性斑馬魚睪丸Esr1基因的轉錄水平顯著降低(P＜0.01),雄性斑馬魚睪丸類固醇途徑相關基因cyp19ala、hsd3b、hsd17b3和hsd20b轉錄水平顯著減少(P＜0.01),雄性斑馬魚睪丸pgr、star、cyp11a1、cyp11b、cyp17和hsd11b2基因的轉錄水平無顯著改變。 與雄性斑馬魚不同,再生水對雌性斑馬魚暴露7 d 顯著上調了卵巢Esr1和cyp11b轉錄水平(P＜0.05)。 再生水對雌性斑馬魚暴露7 d對 卵 巢Ar、pgr、star、cyp11a1、cyp17、cyp19a1a、hsd3b、hsd11b2、hsd17b3和hsd20b轉錄水平無顯著影響(P＞0.05)。

圖1 再生水處理7 d 對斑馬魚腦受體信號途徑、下丘腦和垂體激素相關基因轉錄水平的影響注:結果以 Mean±SEM 表示(n=3);*P＜0.05、**P＜0.01 表示處理組與對照組有顯著差異。Fig.1 Transcriptional profiles of target genes related to the receptor signaling pathways, hypothalamic and pituitary hormones after exposure to reclaimed water for 7 dNote: Results are expressed as Mean±SEM (n=3); *P＜0.05,**P＜0.01 indicate significant differences between the exposure group and the control.

圖2 再生水處理7 d 對斑馬魚性腺受體信號和類固醇途徑相關基因轉錄水平的影響注:結果以 Mean±SEM 表示(n=3);*P＜0.05、**P＜0.01 表示處理組與對照組有顯著差異。Fig.2 Transcriptional profiles of target genes related to the receptor signaling and steroidogenic pathways after exposure to reclaimed water for 7 dNote: Results are expressed as Mean±SEM (n=3);*P＜0.05, **P＜0.01 indicate significant differences between the exposure group and the control.

圖3 再生水處理7 d 對斑馬魚性腺類固醇途徑相關基因轉錄水平的影響注:結果以 Mean±SEM 表示(n=3);**P＜0.01 表示處理組與對照組有顯著差異。Fig.3 Transcriptional profiles of target genes related to the steroidogenic pathways after exposure to reclaimed water for 7 dNote: Results are expressed as Mean±SEM (n=3); **P＜0.01 indicate significant differences between the exposure group and the control.

2.3 再生水暴露14 d 對斑馬魚HPG 軸相關基因轉錄水平的影響

圖4 展示了再生水處理14 d 后,受體信號途徑、下丘腦和垂體激素相關基因的轉錄水平變化。 由圖4 可知,再生水對斑馬魚暴露14 d 后,成年雄性斑馬魚腦Esr1、Fshb和Lhb基因的轉錄水平顯著降低(P＜0.05),成年雄性斑馬魚腦Ar、Gnrh2和Gnrh3基因的轉錄水平無顯著改變(P＞0.05)。 與雄性斑馬魚類似,再生水對雌性斑馬魚暴露14 d 顯著下調了腦Fshb的轉錄水平(P＜0.05),雌性斑馬魚腦Gnrh3的轉錄水平顯著減少(P＜0.01)。 再生水對雌性斑馬魚暴露 14 d 對斑馬魚腦Ar、Esr1、Lhb和Gnrh2轉錄水平無顯著影響(P＞0.05)。 再生水暴露14 d 后,斑馬魚性腺受體信號和類固醇途徑相關基因轉錄水平變化如圖5 和圖6 所示。 由圖5 和圖6 可知,再生水對斑馬魚暴露14 d 后,成年雄性斑馬魚睪丸受體信號途徑雄激素受體Ar和雌激素受體Esr1基因的轉錄水平顯著降低(P＜0.05),成年雄性斑馬魚睪丸類固醇途徑急性調節(jié)蛋白star基因的轉錄水平顯著減少(P＜0.05),雄性斑馬魚睪丸cyp19a1a、hsd11b2和hsd17b3基因轉錄水平顯著下調(P＜0.05),雄性斑馬魚睪丸hsd20b基因轉錄水平顯著下調(P＜0.01),再生水對斑馬魚暴露14 d 對雄性斑馬魚睪丸pgr、cyp11a1、cyp17、hsd3b和cyp11b基因的轉錄水平無顯著影響。 與雄性斑馬魚不同,再生水對雌性斑馬魚暴露 14 d 顯著上調了卵巢Esr1、pgr、cyp19a1a、hsd3b、hsd17b3和star基因轉錄水平(P＜0.05),對卵巢Ar、cyp11a1、cyp17、hsd11b2、hsd20b和cyp11b基因轉錄水平無顯著影響(P＞0.05)。

圖4 再生水處理14 d 對斑馬魚腦受體信號途徑、下丘腦和垂體激素相關基因轉錄水平的影響注:結果以 Mean±SEM 表示(n=3);*P＜0.05、**P＜0.01 表示處理組與對照組有顯著差異。Fig.4 Transcriptional profiles of target genes related to the receptor signaling pathways, hypothalamic and pituitary hormones after exposure to reclaimed water for 14 dNote: Results are expressed as Mean±SEM (n=3);*P＜0.05, **P＜0.01 indicate significant differences between the exposure group and the control.

圖5 再生水處理14 d 對斑馬魚性腺受體信號和類固醇途徑相關基因轉錄水平的影響注:結果以 Mean±SEM 表示(n=3);*P＜0.05 表示處理組與對照組有顯著差異。Fig.5 Transcriptional profiles of target genes related to the receptor signaling and the steroidogenic pathways after exposure to reclaimed water for 14 dNote: Results are expressed as Mean±SEM (n=3); *P＜0.05 indicate significant differences between the exposure group and the control.

圖6 再生水處理14 d 對斑馬魚性腺類固醇途徑相關基因轉錄水平的影響注:結果以 Mean±SEM 表示(n=3);*P＜0.05、**P＜0.01 表示處理組與對照組有顯著差異。Fig.6 Transcriptional profiles of target genes related to the steroidogenic pathways after exposure to reclaimed water for 14 dNote: Results are expressed as Mean±SEM (n=3);*P＜0.05, **P＜0.01 indicate significant differences between the exposure group and the control.

3 討論(Discussion)

再生水暴露對斑馬魚沒有致死效應,并對生長發(fā)育參數(shù)如體長、體質量、生長狀況因子、腦指數(shù)和性腺指數(shù)無顯著影響,說明再生水暴露還沒有產生個體水平的毒理效應。 為了準確分析再生水對水生生物的潛在危害,本研究選擇早期靈敏的分子水平進行分析。 類似地,再生水對溪流搖蚊(Chironomus riparius)個體水平如發(fā)育率、繁殖率和孵化率無顯著影響,對分子水平如內分泌和應激相關基因(Vtg、hsp70、hsc70)表達水平具有顯著影響[11]。 馬拉硫磷和氯氰菊酯對雄性斑馬魚肝指數(shù)和性腺指數(shù)等個體水平指標無顯著影響,但卻在分子水平干擾了HPG軸基因轉錄水平和激素平衡[21]。

為探究再生水對成年斑馬魚毒性效應的分子機制,本研究利用qRT-PCR 技術對成年斑馬魚HPG軸,即腦受體信號途徑、下丘腦和垂體激素以及性腺受體信號和類固醇途徑相關基因的轉錄水平進行分析。 HPG 軸相關基因轉錄水平被廣泛用作內分泌干擾物引起激素改變的分子生物標志物。 雌激素化合物結合HPG 軸相關雌激素受體(ER)通過調節(jié)類固醇激素生物合成從而干擾生物生殖功能[22]。 本研究發(fā)現(xiàn)了再生水能夠調節(jié)與HPG 軸相關基因的轉錄水平,從而可能影響斑馬魚體內雄激素和雌激素的合成,進而干預斑馬魚的生殖能力。 然而,再生水對雌魚和雄魚中的基因的調節(jié)模式是不相同的。

3.1 再生水對斑馬魚腦受體信號途徑、下丘腦和垂體激素相關基因轉錄水平的影響

在HPG 軸中,雌激素受體在性發(fā)育的神經內分泌調節(jié)中起主要作用,雌激素或抗雌激素與雌激素受體直接結合以配體依賴的方式控制雌激素受體。Ar屬于核激素受體超家族與雄激素結合,對性別分化和發(fā)育起重要作用[23]。 Fsh 和Lh 是垂體釋放的參與性激素合成的關鍵促性腺激素[24]。 本研究發(fā)現(xiàn)再生水顯著下調雄性斑馬魚腦Ar和Esr1基因的轉錄水平。 斑馬魚中只有Gnrh2和Gnrh3這2個亞型[25],從腦傳遞來的信號控制下丘腦分泌Gnrh2和Gnrh3,斑馬魚腦中Gnrh基因表達水平的變化會對性激素平衡產生干擾[26]。 本實驗結果顯示再生水對斑馬魚暴露7 d 顯著下調了成年雄性斑馬魚腦Gnrh2和Gnrh3基因的轉錄水平,類似地,斑馬魚暴露于BDE-28 之后,下丘腦和垂體中基因Gnrh2、Gnrh3顯著下調,且與性腺激素合成過程相關的基因卵泡刺激素受體(Fshr)、hsd3b、cyp19a、雌激素受體 a(ERa)和Ar都顯著下調[27]。 Fsh 決定精巢支持細胞的增殖以及促進精子細胞的成熟,而Lh 則作用于精巢中的間質細胞,調節(jié)精子發(fā)生的最后階段[28]。本實驗結果顯示再生水對斑馬魚暴露7 d 顯著下調了成年雄性斑馬魚腦Fshb和Lhb基因的轉錄水平,說明再生水可能通過抑制下丘腦產生Gnrh,降低與垂體上的受體結合,進而影響促性腺激素相關基因的表達水平從而改變Gnrh2和Gnrh3的轉錄水平。低轉錄水平的Gnrh通過促性腺激素釋放激素受體(Gnrhr)作用于垂體,調節(jié)垂體減少分泌Fsh 和Lh,從而可能降低精巢中Fshr 和黃體生成素受體(Lhr)表達,降低Fsh 和Lh 的合成,影響類固醇基因的轉錄水平,干預性激素合成,最終影響雄性斑馬魚精巢組織的正常發(fā)育。Fshb和Lhb基因的表達受HPG軸調控,腦中Fshb和Lhb轉錄水平的減少與先前報道的斑馬魚暴露于三(2-丁氧乙基)磷酸鹽中是一致的[29]。 與雄性斑馬魚不同,再生水對雌性斑馬魚暴露 7 d 對斑馬魚腦Ar、Esr1、Fshb、Lhb和Gnrh2轉錄水平無顯著影響。 類似地,再生水對蝸牛(Physa acuta)雌激素相關受體基因無顯著影響[12]。 再生水對雌性斑馬魚暴露7 d 顯著上調了腦Gnrh3轉錄水平,將會增加Gnrh3 激素水平,從而誘導類固醇基因的轉錄水平和性激素合成,這說明了再生水對雌雄魚腦受體信號途徑、下丘腦和垂體激素相關基因的調節(jié)模式是不同的。

3.2 再生水對斑馬魚性腺類固醇途徑相關基因轉錄水平的影響

本研究發(fā)現(xiàn)再生水能夠調節(jié)性腺受體信號途徑和類固醇途徑相關基因的轉錄水平。 性腺中性類固醇激素的生物合成起源于star介導的膽固醇到線粒體的轉運[30]。 隨后,膽固醇通過cyp11、cyp17、hsd3b和hsd17b等參與的級聯(lián)過程轉化為 T。 最后,在cyp19a 酶的作用下T 轉化為E2,該酶起著調節(jié)斑馬魚類固醇激素水平平衡的關鍵作用,cyp19a基因具有cyp19ala和cyp19alb,cyp19ala基因主要在卵巢中表達,而cyp19alb基因則主要在腦組織中表達[31].。 再生水對雌魚和雄魚中性腺基因的調節(jié)模式也是不相同的。 與腦中雄激素受體Ar和雌激素受體Esr1基因表達模式一致,再生水對斑馬魚暴露7 d 顯著下調了成年雄性斑馬魚睪丸受體信號途徑雄激素受體Ar和雌激素受體Esr1基因的轉錄水平,顯著下調了雄性斑馬魚睪丸類固醇途徑相關基因cyp19a1a、hsd3b、hsd17b3和hsd20b轉錄水平。cyp19ala表達水平的減少可能導致雄激素向雌激素轉化降低,雌激素合成減少,說明了再生水通過干擾類固醇合成途徑對斑馬魚生殖發(fā)育會造成潛在的影響。 hsd17b3 酶涉及雄激素 T 和11-酮基睪酮(11-ketotestosterone,11-KT)的合成。 因此,研究結果說明了再生水能通過干擾hsd17b3基因的轉錄水平進而影響魚體內雄激素的產生,可能通過干擾精巢中原有性激素的平衡,最終對斑馬魚內分泌系統(tǒng)產生不利的影響。 再生水暴露7 d 對雄性斑馬魚睪丸pgr、star、cyp11a1、cyp11b、cyp17和hsd11b2基因的轉錄水平無顯著影響。cyp17基因編碼的細胞色素P45017α-羥化酶是體內雄激素合成的限速酶,在雄激素的生物合成過程中非常重要[32]。star基因在雄性斑馬魚睪丸中是無顯著改變的,說明了類固醇向線粒體的轉移過程沒有受影響。hsd20b是一種關鍵的類固醇合成酶,涉及魚體內特有孕激素17α,20β-DHP 的合成,而hsd11b2基因則涉及雄激素11-KT 的合成[33]。 類似地,甲炔諾酮主要抑制雄魚精巢中Ar基因和類固醇基因star、cyp11a1、cyp11b、hsd20b、hsd17b3和hsd11b2的轉錄水平[34]。 再生水已被報道干擾了雄性斑馬魚的類固醇激素合成,再生水暴露顯著增加了雄性斑馬魚血漿E2 和Vtg 水平,降低了T 水平,降低了E2/T 的比例[2],原因可能是再生水中存在壬基酚、辛基酚、E2 和雙酚A 等內分泌干擾化合物,這些化合物很難通過生物降解和光降解,壬基酚、辛基酚、E2 和雙酚A 等化合物顯著增加了雄性斑馬魚血漿中Vtg 水平。 然而多項研究表明污水生物處理具有較高的雄激素去除效率,所以再生水中幾乎沒有雄激素和抗雄激素效應[2]。其他研究報道微量的環(huán)境內分泌干擾化合物可影響青蛙和鯽魚(Carassius auratus)體內 E2 和 T 的濃度[35-36]。 據(jù)報道,鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)可通過非受體依賴性抗雄激素機制降低斑馬魚中的T 濃度[37-39]。 與從美國野外河流中采集的雄鯉相比,來自美國明尼蘇達州圣保羅大城鎮(zhèn)污水處理廠下游渠道的雄魚的血清Vtg 濃度顯著上調,血清T 濃度顯著降低,E2/T 比例無影響[40]。 本研究結果顯示,與雄性斑馬魚不同,再生水對雌性斑馬魚暴露7 d 顯著上調了卵巢Esr1和cyp11b基因轉錄水平。 再生水對雌性斑馬魚暴露7 d 沒有改變卵巢Ar、pgr、star、cyp11a1、cyp17、cyp19a1a、hsd3b、hsd11b2、hsd17b3和hsd20b轉錄水平,說明再生水對雌性斑馬魚暴露7 d 對性腺類固醇合成相關基因表達影響較小,雄魚對再生水較雌魚敏感。

3.3 再生水對斑馬魚暴露不同時間對HPG 軸相關基因轉錄水平調節(jié)的異同

為了分析再生水處理不同時間對HPG 軸表達模式的影響,本研究還分析了再生水對斑馬魚暴露14 d 對斑馬魚HPG 軸基因轉錄水平的影響。 對于雄性斑馬魚腦受體信號途徑、下丘腦和垂體激素相關基因轉錄水平的影響,與再生水暴露7 d 的表達變化模式相同,再生水對斑馬魚暴露14 d 顯著下調了成年雄性斑馬魚腦Esr1、Fshb和Lhb基因的轉錄水平,然而,與再生水暴露7 d 的表達變化模式不同,再生水對斑馬魚暴露14 d 對成年雄性斑馬魚腦Ar、Gnrh2和Gnrh3基因的轉錄水平無顯著影響,說明隨著暴露時間的延長,雄性斑馬魚可能通過修復機制對再生水產生了一定的適應性。 對于雌性斑馬魚腦受體信號途徑、下丘腦和垂體激素相關基因轉錄水平的影響,與再生水暴露7 d 的表達變化模式不同,再生水對雌性斑馬魚暴露14 d 顯著降低了腦Fshb和Gnrh3的轉錄水平。 與再生水暴露7 d 的表達變化模式相同,再生水對雌性斑馬魚暴露14 d 對斑馬魚腦Ar、Esr1、Lhb和Gnrh2轉錄水平無顯著影響。 對雄性斑馬魚性腺類固醇途徑相關基因轉錄水平的影響,與再生水暴露7 d 的表達變化模式相同,再生水對斑馬魚暴露14 d 顯著下調了成年雄性斑馬魚睪丸受體信號途徑雄激素受體Ar和雌激素受體Esr1基因的轉錄水平,顯著下調了雄性斑馬魚睪丸cyp19a1a、hsd20b和hsd17b3基因轉錄水平,對雄性斑馬魚睪丸pgr、cyp11a1、cyp17和cyp11b基因的轉錄水平無顯著影響。 與再生水暴露7 d 的表達變化模式不同,暴露14 d 顯著下調了成年雄性斑馬魚睪丸類固醇途徑急性調節(jié)蛋白star和hsd11b2基因的轉錄水平,對雄性斑馬魚睪丸hsd3b基因轉錄水平無顯著改變。 因此,再生水對雄性斑馬魚暴露7 d 和14 d 對睪丸類固醇轉錄模式基本相同。 這說明,隨著暴露時間的延長(延長7 d),雄性斑馬魚雖然可通過修復機制在分子水平對再生水產生了一定的適應性,但再生水對斑馬魚分子水平的影響并沒有消除。 對雌性斑馬魚性腺類固醇途徑相關基因轉錄水平的影響,與再生水暴露7 d 的表達變化模式相同,再生水對雌性斑馬魚暴露14 d 對卵巢Ar、cyp11a1、cyp17、hsd11b2和hsd20b轉錄水平無顯著改變,對Esr1基因轉錄水平顯著上調。與再生水暴露7 d 的表達變化模式不同,再生水對雌性斑馬魚暴露 14 d 上調了pgr、cyp19a1a、hsd3b、hsd17b3和star基因轉錄水平,對cyp11b基因轉錄水平無顯著影響。 這說明,再生水暴露時間延長對雌性斑馬魚分子水平產生了更顯著的影響。 因此再生水對雄性斑馬魚和雌性斑馬魚分子水平的影響有差異,這些基因在不同暴露時間的不同轉錄水平說明了它們是與暴露時間相關的轉錄模式。