鎘誘導文蛤鰓細胞凋亡和抗氧化生物標志物的響應

王進華, 柏彬彬, 鄧婉菲, 鄒婷, 應雪萍

溫州大學生命與環(huán)境科學學院,溫州 325035

近年來,由于工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展,重金屬污染已逐漸成為海洋污染的主要污染源之一[1]。重金屬污染來源廣、毒性高,不能在物質循環(huán)和能量交換中降解,并且會通過食物鏈在生物體中富集[1-2],對生物體造成巨大的損傷作用。 鎘(Cd)是一種較為常見的有毒重金屬,在人體內的半衰期長達10 ~30 a,極易在體內積蓄并對細胞、組織和器官產生毒性效應[3]。 Cd 等重金屬可誘導機體產生活性氧自由基(ROS)。 ROS 可以和生物體內的脂質、蛋白質等物質反應,致使膜出現(xiàn)脂質過氧化、蛋白質羰基化(PCO)和 DNA-蛋白質交聯(lián)(DPC)率升高[4],引發(fā)細胞凋亡甚至癌變[5-6]。 但生物體在進化過程中形成了有效的抗氧化防御系統(tǒng),該防御系統(tǒng)由低分子量化合物(維生素 A、C、E、尿酸等)、抗氧化酶及非酶抗氧化物等組成。 機體內重要的抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx),其中SOD 能將超氧化物轉化為氧氣和過氧化氫(H2O2),CAT 催化H2O2產生分子氧和水,而GPx 催化谷胱甘肽(GSH)使有毒的過氧化氫還原成無毒的羥基化合物,能有效地清除自由基并降低氧化損傷[7-8]。 但過量的ROS 超過了機體的抗氧化能力時,將會破壞抗氧化酶的功能[8]。Na+-K+ATP 酶和Ca2+-Mg2+ATP 酶是廣泛存在于生物膜上的酶,對維持細胞的正常生命活動具有積極作用。 ATP 酶既可以作為酶催化ATP 釋放大量能量供應機體代謝所需,也可以作為載體運輸細胞所需的物質[9]。 研究表明,過量的ROS 會破壞機體內ATP 酶系統(tǒng),Na+-K+ATP 酶和 Ca2+-Mg2+ATP 酶的損傷可能會導致離子失衡和細胞內Ca2+的蓄積[10]。 金屬硫蛋白(MT)是富含半胱氨酸的非酶抗氧化劑,能夠結合金屬離子來減緩自由基的產生,直接參與抗氧化防御反應,以保護細胞免受重金屬的毒害作用[11]。

軟體動物是水生生態(tài)系統(tǒng)中的主要組成成分,可通過攝食、呼吸和體表滲透等方式富集水體環(huán)境中的Cd[12-13]。 雙殼類軟體動物由于其埋棲和濾食的生活方式,對重金屬十分敏感,故在水生毒理學研究及評價上具有重要的意義。 而作為呼吸器官的鰓直接與水體長期接觸,Cd 等重金屬易在鰓中富集并對其產生氧化損傷效應[14]。 有研究表明,鰓比其他器官更易受到重金屬的污染,可作為環(huán)境中重金屬污染的指示組織[13,15]。 文蛤(Meretrix meretrix)隸屬于雙殼綱(Bivalvia)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤屬(Meretrix),具有較高的營養(yǎng)及生態(tài)價值,是我國重要的經濟養(yǎng)殖種類之一,文蛤已逐漸被用于水環(huán)境中重金屬污染的指示生物[16-17]。 有研究報道,Cd 等重金屬對文蛤具有很強的毒性效應,如能抑制文蛤性腺抗氧化酶的活性,并導致膜脂質過氧化[18],能誘導幼體酶活性和抗氧化能力下降[19],高濃度Cd2+會顯著誘導肝胰腺細胞凋亡[7]。 我們的前期研究發(fā)現(xiàn),文蛤鰓對Cd2+的富集顯著高于肝胰腺、足和外套膜[15],但Cd2+對文蛤鰓造成的氧化損傷、對抗氧化生物標志物的影響以及凋亡機制尚不清楚。 故本研究以文蛤為研究對象,旨在探討急性Cd2+暴露對文蛤鰓組織的毒理效應,并探討抗氧化生物標志物在Cd2+誘導文蛤鰓細胞凋亡中的響應情況。 該研究結果可以讓我們更好地了解文蛤等雙殼類動物的抗氧化防御系統(tǒng)是如何應對Cd2+的毒性效應,為進一步研究文蛤鰓細胞凋亡機制提供理論基礎;同時為水生環(huán)境中Cd2+污染檢測生化標志物的篩選提供了潛在的應用前景。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)(AR,≥99%)購自天聯(lián)精細化工有限公司。 KCl(AR,99.5%)、HCl(36% ~38%)、無水乙醇(AR,≥99.7%)、乙酸乙酯(AR,99.9%)和三氯乙酸(AR,99%)購自浙江中星化工試劑有限公司。 蛋白酶 K 溶液(20 mg·mL-1)、鹽酸胍(99%)和硫酸鏈霉素(98%)均購自麥克林公司。 三羥甲基氨基甲烷(Tris,99.9%)、2,4-二硝基苯肼(DNPH,98%)和十二烷基硫酸鈉(SDS,95%)均購自Solarbio 公司。 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染料購自南京基根生物技術有限公司。 DNA 提取測定試劑盒購自天根生物技術有限公司。 SOD、CAT、GPx、ROS、總抗氧化能力(T-AOC)、Na+-K+ATP、Ca2+-Mg2+ATP 和總ATP 酶試劑盒均購自南京建成生物公司。 DNA marker 和 PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒均購自 Takara 公司。 AccuPower 2X Greenstar qPCR Master Mix 試劑盒購自 Bioneer 公司,UNIQ-10 柱式Tizol 總RNA 提取試劑盒購自生工股份有限公司。

1.2 動物處理

實驗所用的文蛤購自浙江省靈昆養(yǎng)殖場,殼長(52.72±2.20) mm,殼寬(26.95±1.26) mm,殼高(43.41±1.88)mm,體質量(39.06±4.81)g。 文蛤養(yǎng)殖場的海水和沉積物中 Cd 含量分別為0.54 μg·L-1和0.89 mg·kg-1。 將文蛤放置在6個裝有10 L 15‰人工海水的養(yǎng)殖缸(67 cm×46 cm×36.5 cm)中適應養(yǎng)殖2 d,溫度為(22±1) ℃,pH 為 7.9。 根據(jù) Cd2+對文蛤 96 h LC50(15.01 mg·L-1)[7]的 1/10、1/5、1/2.5 和 1/1.25 設置 Cd2+的染毒濃度分別為 0、1.5、3、6 和 12 mg·L-1。各濃度組均設3個平行樣,共15個養(yǎng)殖缸,每個養(yǎng)殖缸分別加入不同濃度的Cd2+溶液5.5 L,大小相近的625 只文蛤平均放入15個裝有不同濃度Cd2+溶液的養(yǎng)殖缸中,24 h 更換新鮮的不同濃度Cd2+溶液,期間不喂食。 染毒5 d 后于冰上取文蛤鰓組織,立即放入液氮冷凍,然后置于-80 ℃冰箱中備用,用于各指標的測定。

1.3 鰓細胞氧化損傷和凋亡檢測

1.3.1 AO/EB 雙熒光檢測鰓細胞凋亡

按照Ribble 等[20]描述的方法以及AO/EB 試劑盒中的相關說明對鰓細胞凋亡進行檢測。 取不同Cd2+濃度組的鰓組織各50 mg,在預冷的1% PBS(pH=7.2)中制備細胞懸液,取制備好的細胞懸液各25 μL 與 1 μL AO/EB 水溶液混合并孵育 5 min,用熒光顯微鏡(尼康Ti-s,日本)觀察并拍照。

1.3.2 DNA 片段檢測鰓細胞凋亡

取不同Cd2+濃度組的鰓組織50 mg 至裝有500 μL 生理鹽水的離心管中,在冰上充分研磨成懸浮液,并在 11 200 r·min-1(4 ℃)下離心 1 min。 除去上清液,將沉淀物用于DNA 片段的提取。 根據(jù)DNA提取試劑盒說明書的相關要求和步驟提取DNA。將 DNA 樣品混合物(8 μL DNA 提取物,3 μL 溴酚藍)添加到每個泳道中,泳道中有含1%瓊脂糖凝膠(包含 0.1 mg·mL-1溴化乙錠)的 0.5×TBE 緩沖液,并于58 V 進行電泳1 h。 用Gel Doc 2000 凝膠成像系統(tǒng)(Tanon,上海,中國)在紫外線下對所得的條帶進行觀察并拍照。

1.3.3 蛋白質羰基(PCO)含量檢測

取不同濃度Cd2+溶液染毒后的鰓組織50 mg,加入9 倍體積的HEPES 緩沖液進行研磨,勻漿液于3 000 r·min-1下離心 10 min,取 200 μL 上清液,加入9 倍體積的10%硫酸鏈霉素溶液,室溫放置10 min,然后取樣品各100 μL,分別加入2 mol·L-1HCl溶液400 μL 作為對照管以及 400 μL DNPH 溶液作為測定管,在黑暗中反應1 h,每10 min 搖勻一次。再在對照管和測定管中加入500 μL 的20% 三氯乙酸(TCA)溶液,離心 15 min(4 ℃、12 000 r·min-1)后棄上清,沉淀物加乙醇-乙酸乙酯溶液(V(無水乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1 ∶1)1 mL 洗滌并離心 10 min(4 ℃ 、12 000 r·min-1),重復 3 次后加鹽酸胍 1 mL 溶解沉淀,37 ℃水浴15 min 后再離心15 min(4 ℃、12 000 r·min-1),取上清液用分光光度計于370 nm 波長處測 OD 值。

1.3.4 DNA-蛋白質交聯(lián)率(DPC)檢測

參照Xie 等[21]的方法進行DPC 檢測,即取不同濃度Cd2+溶液染毒后的鰓組織0.1 g,按質量(g)∶體積(mL)=1 ∶9 的比例加入 9 倍 PBS 緩沖液進行研磨,得10%的組織勻漿液。 取500 μL 勻漿液于離心管中,加入500 μL SDS 溶液進行輕微振蕩,65 ℃水浴 10 min 后加 100 μL Tris-HCl-KCl 液,移液槍吹打 8 次。 冰上驟冷樣品 5 min,4 ℃ 下 12 000 r·min-1離心10 min(以下離心條件相同),收集上清液于另一離心管。 向沉淀中加入1 mL 緩沖液重懸65℃水浴10 min,冰上驟冷5 min 后離心,將上清液轉入上述離心管中(此步驟重復3 次)。 將終沉淀重懸于 500 μL 清洗緩沖液中,加 500 μL 蛋白酶 K,50℃消化3 h,冰上驟冷5 min 后離心,收集上清消化液于另一離心管中。 上清液和消化液各取100 μL于酶標板,分別加入100 μL 熒光染料后置于暗處反應30 min。 用多功能酶標儀(Biotek Epoch,USA)(Ex=350 nm,Em=460 nm)測定待測樣品熒光強度。

1.3.5 ROS 和 T-AOC 測定

ROS 測定:取不同濃度Cd2+溶液染毒后的新鮮鰓組織0.1 g,剪碎放在200 目尼龍網上,并將網扎在小燒杯上,用眼科鑷邊搓邊用PBS 沖洗,將組織搓完,加 PBS 至 2 000 μL,用 300 目尼龍網過濾,取800 μL 于 1.5 mL 離心管,4 ℃下 3 000 r·min-1離心10 min,棄上清。 加 400 μL 熒光染料 DCFH-DA 混勻后37 ℃水浴孵育1 h,每3 ~5 min 顛倒混勻;孵育1 h 后,在離心管中加入 800 μL PBS 在 4 ℃下3 000 r·min-1離心 5 min 后棄上清液,重復操作 2 次后加 1 mL PBS 混勻。 取 200 μL 待測樣品于 96 孔板,用酶標儀(Biotek Epoch, USA)(Ex=488,Em=525)測熒光強度。

T-AOC 檢測:稱取文蛤鰓組織0.1 g,按質量(g)∶體積(mL)=1 ∶9,加入 9 倍生理鹽水,冰浴機械勻漿,制備10%的組織勻漿,4 ℃、2 500 r·min-1,離心10 min,取上清液。 按照南京建成提供的T-AOC 試劑盒使用說明進行操作,用多功能酶標儀(Biotek Epoch, USA)對其進行檢測。

1.4 抗氧化生物標志物的測定

1.4.1 氧化應激酶活性測定

樣本前處理:稱取文蛤鰓組織0.1 g,按質量(g)∶體積(mL)=1 ∶9,加入9 倍生理鹽水,冰浴機械勻漿,制備10%的組織勻漿,4 ℃、2 500 r·min-1,離心10 min,取上清液用于氧化應激酶活性的測定。 SOD、CAT、GPx、Na+-K+ATP、Ca2+-Mg2+ATP 和總 ATP 酶活性的測定均按照南京建成提供的試劑盒使用說明進行。 酶活性單位采用U·mg-1表示。

1.4.2MTmRNA 表達量測定

用UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒對鰓組織總RNA 進行抽提,凝膠電泳檢測RNA 質量,紫外分光光度法測定RNA 含量。 以文蛤鰓總RNA 為模板,使用 PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒將總RNA 進行反轉錄得到cDNA。

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫已公布的文蛤金屬硫蛋白MT-1基因序列(GenBank:GU233466)[19]設計文蛤MT特異性引物。 以文蛤鰓cDNA 為模板,以文蛤MT引物為特異性引物,β-actin 引物作為內參,使用Roche LC480 熒光定量 PCR 儀和 AccuPower 2X Greenstar qPCR Master Mix 試劑盒對鰓組織中MTmRNA 表達進行相對定量分析。 PCR 條件如下:95℃預變性5 min,95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72℃延伸20 s,共40個循環(huán)。 同時設置陰性對照,反應體系中不加入cDNA,總體積為20 μL 不變。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗所得的數(shù)據(jù)均用SPSS 25 軟件進行分析,用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和LSD 檢測差異顯著性,用OriginPro 9.0 對所得數(shù)據(jù)進行相關圖形的繪制。 數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(Mean±S.D.)表示,P＜0.05 即為差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 文蛤鰓細胞AO/EB 熒光顯微觀察

如圖1 所示,對照組及1.5 mg·L-1Cd2+處理組的鰓細胞形態(tài)圓潤無褶皺,綠色熒光著色均勻,表明細胞無明顯凋亡現(xiàn)象(圖1(a)~(b))。 隨Cd2+濃度的升高,呈橙黃色和紅色熒光的細胞逐漸增多,說明細胞正常的生理結構有破損,并開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象(圖1(c)~(e))。 3 mg·L-1Cd2+實驗組中,部分鰓細胞出現(xiàn)橘黃色熒光,呈綠色熒光的細胞數(shù)量變少(圖1(c))。 較高 Cd2+濃度組(6 ~12 mg·L-1)的鰓細胞形態(tài)異常,細胞核皺縮,個別細胞呈現(xiàn)“新月形”,且以橙黃色和紅色熒光細胞為主(圖1(d)~(e))。 由此可見,隨著Cd2+濃度的加大,細胞凋亡逐漸增強。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢驗文蛤鰓細胞DNA 完整性

對照組、1.5 mg·L-1和 3 mg·L-1Cd2+濃度組的文蛤鰓細胞無明顯的梯形條帶出現(xiàn)(圖1(f) g ~i),說明細胞DNA 相對完好;隨Cd2+染毒濃度的增加(6 mg·L-1和12 mg·L-1Cd2+),文蛤鰓細胞DNA 梯狀斷裂條帶逐漸明顯,每個條帶的間隔約200 bp(圖1(f) j~k),說明隨著Cd2+濃度的增加細胞凋亡程度不斷加劇。

圖1 不同濃度Cd2+染毒組文蛤鰓細胞AO/EB 和DNA Ladder 檢測圖注:(a)~(e) AO/EB 圖,(f) 凝膠電泳圖;(a)0 mg·L-1,(b)1.5 mg·L-1,(c)3 mg·L-1,(d)6 mg·L-1,(e)12 mg·L-1,(f) m 表示 marker,g 表示 0 mg·L-1,h 表示 1.5 mg·L-1,i 表示 3 mg·L-1,j 表示 6 mg·L-1,k 表示 12 mg·L-1。Fig.1 AO/EB fluorescence microscopy analysis and DNA fragmentation in the gill of M. meretrix exposed to different Cd2+ concentrationsNote: (a)~(e) AO/EB fluorescence microscopy analysis, (f) Gel electrophoresis image; (a)0 mg·L-1,(b)1.5 mg·L-1, (c)3 mg·L-1, (d)6 mg·L-1, (e)12 mg·L-1, (f) m represents marker, g represents 0 mg·L-1,h represents 1.5 mg·L-1, i represents 3 mg·L-1, j represents 6 mg·L-1, and k represents 12 mg·L-1.

2.3 Cd2+對文蛤鰓DPC 和PCO 水平的影響

文蛤鰓DPC 和PCO 水平均隨Cd2+濃度上升而上升,在12 mg·L-1Cd2+濃度組中達到最大值,呈明顯的劑量-效應關系(圖2)。 對照組的 DPC 水平與各Cd2+濃度組均有顯著差異(P＜0.05),但1.5 mg·L-1和3 mg·L-1Cd2+濃度組差異不顯著(P＞0.05)(圖2 黑色柱子)。 而文蛤鰓中PCO 水平在對照組和各Cd2+濃度組均有顯著差異(P＜0.05) (圖2 白色柱子)。

圖2 Cd2+對文蛤鰓DNA-蛋白質交聯(lián)率(DPC)和蛋白質羰基(PCO)水平的影響注:不同字母表示有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),n=6;下同。Fig.2 Effect of Cd2+ on DNA-protein crosslinks (DPC)and protein carbonyl (PCO) level of M. meretrix gillsNote: The different letters indicate significant differences among groups (P＜0.05), n=6; the same below.

2.4 Cd2+對文蛤鰓T-AOC 和ROS 水平的影響

隨著Cd2+濃度的上升,ROS 水平不斷上升,在12 mg·L-1Cd2+濃度組達到最大值。 對照組文蛤鰓中ROS 含量除與1.5 mg·L-1Cd2+處理組無顯著差異外(P＞0.05),與其他Cd2+濃度組均有顯著差異(P＜0.05)(圖 3 黑色柱子)。 T-AOC 水平隨 Cd2+濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在1.5 mg·L-1Cd2+濃度組達最高水平,且與對照組及其他Cd2+濃度組均有顯著差異;12 mg·L-1Cd2+濃度組達最低水平且與對照組及其他實驗組均差異顯著(P＜0.05),但對照組、3 mg·L-1Cd2+及 6 mg·L-1Cd2+濃度組間無顯著差異(圖 3 白色柱子)。

圖3 Cd2+對文蛤鰓總抗氧化能力(T-AOC)和活性氧(ROS)水平的影響Fig.3 Effect of Cd2+ on total antioxidant capacity (T-AOC)and reactive oxygen species (ROS) level of M. meretrix gills

2.5 Cd2+對文蛤鰓抗氧化酶活性的影響

如圖4 ~6 所示,文蛤鰓抗氧化酶(SOD、CAT 和GPx)活性隨著Cd2+濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢。 SOD 和 CAT 活性均在 1.5 mg·L-1Cd2+濃度達最大值,與對照組和其他Cd2+濃度組均差異顯著(P＜0.05)。 對照組的 SOD 活性與 3 mg·L-1和 6 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異(P＞0.05),12 mg·L-1濃度組SOD 活性最小,與對照組及其他各Cd2+濃度組均有顯著差異(P＜0.05) (圖 4)。 對照組的 CAT 活性除與12 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異外,與其他各組均差異顯著(P＜0.05) (圖 5)。 對照組 GPx 活性與其他各組均無顯著差異(圖6)。

圖4 Cd2+對文蛤鰓超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.4 Effect of Cd2+ on superoxide dismutase (SOD)activity of M. meretrix gills

圖5 Cd2+對文蛤鰓過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig.5 Effect of Cd2+ on catalase (CAT)activity of M. meretrix gills

圖6 Cd2+對文蛤鰓谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性的影響Fig.6 Effect of Cd2+ on glutathione peroxidase (GPx)activity of M. meretrix gills

2.6 Cd2+對文蛤鰓ATP 酶活性的影響

ATP 酶活性隨Cd2+染毒濃度的增加呈現(xiàn)明顯的抑制狀態(tài),對照組ATP 酶活性與1.5 mg·L-1和3 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異,但 12 mg·L-1Cd2+濃度組的ATP 酶活性顯著低于對照組及其他染毒組(P＜0.05)(圖7 ~ 圖9)。 Na+-K+ATP 酶活性在6 mg·L-1和12 mg·L-1Cd2+濃度組顯著低于對照組,且與其他各組均有顯著差異(P＜0.05) (圖 7)。 Ca2+-Mg2+ATP 酶活性在 12 mg·L-1與6 mg·L-1Cd2+濃度組間無顯著差異(圖8)。 6 mg·L-1和12 mg·L-1Cd2+濃度組的T-ATP 酶活性顯著低于對照組,且與其他各組均有顯著差異(P＜0.05) (圖9)。

圖7 Cd2+對文蛤鰓Na+-K+ATP 酶活性的影響Fig.7 Effect of Cd2+ on Na+-K+ATPase activity of M. meretrix gills

圖8 Cd2+對文蛤鰓Ca2+-Mg2+ATP 酶活性的影響Fig.8 Effect of Cd2+ on Ca2+-Mg2+ATPase activity of M. meretrix gills

圖9 Cd2+對文蛤鰓總ATP 酶活性的影響Fig.9 Effect of Cd2+ on total ATPase (T-ATPase)activity of M. meretrix gills

2.7 Cd2+對文蛤鰓MT mRNA 表達量的影響

文蛤鰓MTmRNA 的表達量隨Cd2+染毒濃度增大出現(xiàn)先增后減的趨勢(圖10)。 1.5 mg·L-1Cd2+濃度組MTmRNA 的表達量最大,除與3 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異外,與其他各組均差異顯著(P＜0.05);但對照組與12 mg·L-1Cd2+濃度組無顯著差異(P＞0.05)。

圖10 Cd2+對文蛤鰓MT mRNA 表達量的影響Fig.10 Effect of Cd2+ on MT mRNA expression of M. meretrix gills

3 討論(Discussion)

3.1 Cd2+對水生動物的氧化損傷和細胞凋亡效應

3.2 Cd2+脅迫下氧化應激酶和金屬硫蛋白mRNA(MT mRNA)的作用特點

SOD、CAT 和GPx 等抗氧化酶的活性變化可作為檢驗環(huán)境中重金屬污染的生化標志物,這些酶活性的降低會導致細胞發(fā)生氧化損傷[29-30]。 Cd2+可通過結合抗氧化酶的活性位點來改變酶的空間結構,使得其活性下降,導致機體清除ROS 的能力下降[19,31]。 文蛤鰓 SOD 和 CAT 的活性隨著 Cd2+濃度的增加呈先上升后下降趨勢,均在1.5 mg·L-1濃度組達到最大值(圖4 ~圖6),說明較低Cd2+濃度下(0~1.5 mg·L-1)SOD 和CAT 的誘導可能是機體應對外來重金屬的防御反應機制。 邢慧芳等[32]和于慶云等[33]分別研究了重金屬對無齒蚌(A. woodiana woodiana)和菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)抗氧化酶的影響,也得出相似的結果。 這可能是在較低濃度Cd2+脅迫下,機體內產生少量的作為底物誘導SOD 的表達;但較高濃度的Cd2+(3 ~12 mg·L-1)可置換SOD 活性中心中的必需金屬并與其結合導致其酶活性降低,這與前人對文蛤(M. meretrix)幼體[19]、斑馬魚(Danio rerio)[22]和海洋纖毛蟲(Euplotes crassus)[34]的研究結果一致。 同時,低濃度Cd2+誘導下機體中SOD 酶活性增加會催化產生大量的H2O2,過多的H2O2刺激CAT 或通過線粒體和細胞質中的GPx 將其分解轉化為無毒的O2和H2O,但隨著Cd2+濃度的增加會產生過量的H2O2使得機體內的CAT 和GPx 酶過度消耗,從而出現(xiàn)CAT 和GPx 酶活性下降的趨勢[15,18,30,35]。

ATP 酶是不可或缺的膜蛋白,能介導Na+、K+和Ca2+等離子在細胞中進行跨膜轉運[36];并能調節(jié)細胞滲透壓和膜通透性,金屬離子可與ATP 酶的半胱氨酸巰基(—SH)作用來改變蛋白質功能[37]。 ATP 酶的活性取決于其與富含多不飽和脂肪酸(PUFA)的磷脂的相互作用[38]。 有研究表明,Na+-K+ATP 酶和Ca2+-Mg2+ATP 酶可作為器官功能的生物標記物[39]。Abdulkareem 等[10]發(fā)現(xiàn)污水能顯著降低小鼠(Mus musculus)心臟Na+-K+ATP 酶活性,并略微降低小鼠心臟Ca2+-Mg2+ATP 酶活性。 Wang 和 Horisberger[40]認為Hg2+與Na+-K+ATP 酶的半胱氨酸殘基結合是Hg 抑制 Na+-K+ATP 酶的機制之一。 Pivovarova 和Lagerspetz[41]認為二價重金屬陽離子可能通過與Ca2+位點或Mg2+位點結合而抑制Ca2+-Mg2+ATP 酶活性。 文蛤鰓細胞 Na+-K+ATP 酶、Ca2+-Mg2+ATP酶、總 ATP 酶活性均與 Cd2+濃度(0 ~12 mg·L-1)呈負相關(圖7 ~圖9),說明Cd2+可能與ATP 酶的半胱氨酸巰基(—SH)或離子結合,從而影響其氧化應激功能。 吳眾望等[42]對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的研究表明,在較低重金屬濃度處理時,鰓短時間內表現(xiàn)為促進作用,而較高濃度下為顯著性抑制。 但本研究發(fā)現(xiàn)較低Cd2+濃度(1.5 ~3 mg·L-1)對文蛤鰓ATP 酶影響不大,與對照組無顯著差異;但較高 Cd2+濃度(6 ~12 mg·L-1)文蛤鰓中 ATP 酶活性顯著下降。 McGeer 等[43]認為虹鱒(Oncorhynchus mykiss)長時間暴露于低濃度Cu2+時,鰓絲Na+-K+ATP 酶活性顯著升高,這可能會導致代謝負擔增加。Zhao 等[37]研究發(fā)現(xiàn)Ca2+-Mg2+ATP 酶活性的降低會破壞中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)鰓上皮細胞中Ca2+和Mg2+的穩(wěn)態(tài),并影響ATP 的合成,可能會導致能量代謝出現(xiàn)問題,并最終損害鰓的正常生理功能。 本研究發(fā)現(xiàn)較高 Cd2+濃度(6 ~12 mg·L-1)誘導下文蛤鰓細胞凋亡率明顯上升,說明ATP 活性的降低直接破壞鰓上皮,影響其生理功能。

MT 是一種低分子量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白,由2個功能獨立的球形結構域組成,促進其與二價金屬(例如Cd2+和Zn2+)的結合,在金屬元素的平衡、調節(jié)和解毒等方面具有重要的作用[44-45]。Cd2+(0 ~12 mg·L-1)會誘導文蛤鰓MTmRNA 的表達(圖10),機體可通過合成更多的MT 來抵抗Cd2+的毒害。 這可能是重金屬Cd2+進入細胞后,產生的“毒物興奮效應”,誘使MTmRNA 迅速表達,對重金屬進行解毒作用[46-47]。 但當Cd2+濃度繼續(xù)增加(3~12 mg·L-1)時,文蛤鰓組織MTmRNA 的表達量出現(xiàn)下降的趨勢(圖10),這可能是過多的Cd 進入細胞后將誘導MT 表達并與之結合形成Cd-MT 復合物,該復合物有可能進入核內促使DNA 雙鏈的降解[44,48]。 MT 是生物抵御重金屬毒害的重要防線,MT 結合重金屬達到飽和時,剩余的重金屬將會在體內累積并誘導機體產生ROS,或直接與酶活性中心的巰基(—SH)結合占據(jù)其活性中心的位置,降低抗氧化酶活性和清除自由基的能力,致使機體產生氧化損傷[11,47]。 Rocha 等[11]的研究也發(fā)現(xiàn),當貽貝(Mytilus galloprovincialis)暴露在不同濃度Cd2+3 d和14 d 后,貽貝鰓和消化腺中MT 的表達取決于Cd2+濃度和暴露時間。 目前的研究都表明水生動物對重金屬的耐受性與富含半胱氨酸的蛋白質含量之間具有一定的相關性,但MT 在文蛤細胞氧化損傷和凋亡中的作用機制有待于進一步研究。

綜上所述,在Cd2+濃度低于1.5 mg·L-1時文蛤機體中的酶和非酶抗氧化劑在短時間內能抵御Cd2+對機體的毒害作用,但隨著濃度的增加,即使在遠低于LC50的濃度下,機體也會產生氧化損傷甚至細胞凋亡,且具濃度依賴關系。 其潛在的毒性機制可能是Cd2+誘導機體產生ROS,促使細胞膜脂質過氧化、蛋白質羰基化以及DNA 和蛋白質發(fā)生交聯(lián),導致細胞ATP 酶活性受抑制,能量代謝紊亂。 在Cd2+濃度較低(0 ~1.5 mg·L-1)時,MT 和抗氧化酶被激活有助于緩解Cd2+的毒性作用,但環(huán)境中Cd2+濃度的持續(xù)增加(3 ~12 mg·L-1)會導致MT 的耗盡和抗氧化酶的失活,最終導致細胞凋亡。