氯胺酮致小鼠發(fā)育期神經(jīng)毒性中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)變化

李春竹 李文龍 王 皓 嚴(yán) 佳 周徐慧 馬曉凡 徐安妮 姜 虹

大腦的發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，包括各種神經(jīng)的分化成熟、突觸的發(fā)生，以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的重塑等[1-2]。多項(xiàng)針對(duì)發(fā)育期動(dòng)物，如嚙齒類動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究[3]已證實(shí)，麻醉藥物會(huì)使發(fā)育期大腦神經(jīng)元發(fā)生凋亡等退行性改變，產(chǎn)生持久的認(rèn)知功能、行為和記憶方面的缺陷。另一方面，大量針對(duì)兒科患者進(jìn)行的回顧性研究[4]結(jié)果表明，反復(fù)或長(zhǎng)時(shí)間的麻醉會(huì)對(duì)發(fā)育期大腦產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致信息處理速度和精細(xì)運(yùn)動(dòng)等功能顯著受損。氯胺酮是臨床常用的麻醉藥物之一，主要應(yīng)用于兒科手術(shù)麻醉。長(zhǎng)時(shí)間或多次給予氯胺酮會(huì)損害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)育，造成其遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙?？赡苌婕暗臋C(jī)制包括氯胺酮能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響神經(jīng)元的分化生長(zhǎng)、樹(shù)突棘形成及突觸可塑性改變等[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)的一種[6]。與其他組織相比，大腦中l(wèi)ncRNAs的富集程度高，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守[7-8]，還表現(xiàn)出很強(qiáng)的時(shí)間、空間特異性[9-10]。上述特點(diǎn)均表明，lncRNAs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能調(diào)控的重要因子。由于lncRNAs的表達(dá)特異度高，可作為生物標(biāo)志物，在神經(jīng)發(fā)育方面的應(yīng)用有著廣闊的前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)孕14～16 d的雌性C57BL/6小鼠，以及出生后第7～9天的C57BL/6新生小鼠，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司上海分公司。將所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)的動(dòng)物房中，單籠飼養(yǎng)，溫度(25 ℃)和濕度(50%)維持恒定，提供無(wú)限量食物和水，光暗周期為12 h(光控系統(tǒng)，早上7時(shí)至晚上7時(shí)光照，晚上7時(shí)至次日早上7時(shí)黑暗)。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0011，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(滬)2016-0016。

1.1.2 主要試劑和儀器 氯胺酮購(gòu)自福建古田藥業(yè)有限公司，Neurobasal培養(yǎng)基、胎牛血清、B27無(wú)血清補(bǔ)充劑、GlutaMAXTM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，木瓜蛋白酶、多聚賴氨酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TRIzol試劑、轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine3000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit RR037A)購(gòu)自日本TaKaRa公司，所有引物均由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成，蛋白質(zhì)定量試劑盒、強(qiáng)效蛋白裂解液、辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光液、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、兔抗鼠[bcl-2、Bax、激活半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase3)、GAPDH]單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，綠色熒光蛋白質(zhì)粒由上海吉滿生物科技有限公司構(gòu)建。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀QuantStudio 6&7 Flex購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，化學(xué)發(fā)光成像儀ImageQuant LAS 6000購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物處理 以0.9%氯化鈉溶液稀釋氯胺酮至10 mg/mL，將新生小鼠隨機(jī)分為氯胺酮組(予小鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮100 mg/kg)和對(duì)照組(予小鼠腹腔內(nèi)注射等體積0.9%氯化鈉溶液)，連續(xù)3 d給藥，末次給藥后24 h取小鼠海馬組織。體外海馬神經(jīng)元在種板后第3天分別給予濃度為0(即對(duì)照組)、50、100 μmol/L的氯胺酮，給藥6 h后換液，種板后第5天收樣。

1.2.2 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 將孕14～16 d的小鼠麻醉，以75%乙醇消毒其腹部，沿中線剪開(kāi)，取出胚胎置于預(yù)冷的Hank’s平衡鹽緩沖液(Hank’s balanced salt solution, HBSS)。于冰上操作，沿中縫將全腦分為左右半腦，去除腦膜，游離海馬并取出，轉(zhuǎn)移至新的HBSS中。以HBSS洗滌3次后，將海馬組織吸至含1 mg/mL papain的Neurobasal培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中消化30 min。加入含胎牛血清培養(yǎng)基終止消化。使用移液槍輕柔吹打組織，細(xì)胞過(guò)濾篩網(wǎng)濾過(guò)神經(jīng)元。1 000×g離心3 min后吸棄上層培養(yǎng)基后重懸，采用錐蟲(chóng)藍(lán)染色后計(jì)數(shù)存活神經(jīng)元的數(shù)量。24孔板培養(yǎng)神經(jīng)元按1.5×105/孔進(jìn)行種板。1 h后更換為含B27的Neurobasal培養(yǎng)基。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting) 使用RIPA裂解液將組織或細(xì)胞裂解后按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，加入1×上樣緩沖液，95 ℃煮10 min。配制12%聚丙烯酰胺凝膠，加入樣品，恒壓60 V電泳30 min后調(diào)至120 V繼續(xù)電泳。電泳結(jié)束后采用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，恒流0.1 A 60 min。按照預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量切割條帶，用5%脫脂牛奶于室溫封閉2 h，再以稀釋后的GAPDH抗體(1∶1 000)、bcl-2抗體(1∶1 000)、Bax抗體(1∶1 000)和cleaved-caspase3抗體(1∶500)孵育對(duì)應(yīng)條帶，4 ℃搖床過(guò)夜。以Tris緩沖液(TBST)洗滌3次，每次10 min；二抗(1∶10 000)孵育1 h后，以TBST洗滌3次，每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光液后顯影。應(yīng)用Image J軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析bcl-2/Bax、cleaved-caspase3蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 原代神經(jīng)元樹(shù)突形態(tài)分析 原代培養(yǎng)神經(jīng)元，種板后第2天轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒，種板后第3天同1.2.1進(jìn)行藥物處理。種板后第5天經(jīng)4%多聚甲醛固定后，使用0.15%TritonX-100于室溫下穿膜30 min，用5% BSA封閉1 h。一抗4 ℃孵育過(guò)夜。以磷酸鹽緩沖液洗滌3次后熒光二抗避光孵育1 h，磷酸鹽緩沖液洗滌3次。封片后避光保存。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡拍攝，Image J軟件描摹出完整的樹(shù)突一級(jí)分支和二級(jí)分支，統(tǒng)計(jì)最大分支數(shù)。

1.2.5 lncRNAs測(cè)序及分析 使用TRIzol試劑提取小鼠海馬組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑反轉(zhuǎn)錄lncRNAs。在Illumina HiSeq2000平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。適配序列從原始測(cè)序數(shù)據(jù)中獲得。將單個(gè)文庫(kù)轉(zhuǎn)換為FASTQ格式，應(yīng)用TopHat2 v2.0.9軟件與小鼠基因組進(jìn)行比對(duì)，并應(yīng)用Cufflink v2.1.1軟件整合映射的轉(zhuǎn)錄本以行進(jìn)一步分析。以表達(dá)改變倍數(shù)|log2(FC)|≥1和P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別顯著差異表達(dá)的lncRNAs，應(yīng)用Omicshare Tools軟件制作火山圖與熱圖。對(duì)差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行基因本體(Gene Ontplogy,GO)分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路數(shù)據(jù)庫(kù)分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分析 從測(cè)序結(jié)果中挑選7個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行檢驗(yàn)，在Pubmed Gene網(wǎng)站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查詢得到所有l(wèi)ncRNAs序列。通過(guò)提供序列在Primer(version 0.3.0)在線工具(https:∥bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)中設(shè)計(jì)引物。使用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒對(duì)篩選出的lncRNAs進(jìn)行RT-qPCR分析。以小鼠GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組與氯胺酮組體內(nèi)和體外海馬神經(jīng)元凋亡情況比較 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，氯胺酮組小鼠海馬組織中bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)量為0.568±0.041，顯著低于對(duì)照組的0.959±0.035(P<0.01)；cleaved-caspase3相對(duì)表達(dá)量為2.271±0.065，顯著高于對(duì)照組的1.222±0.120(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

1～3 對(duì)照組 4～6 氯胺酮組

在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中，氯胺酮50 μmol/L組和100 μmol/L組的bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.01)，cleaved-caspase3相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.01)。氯胺酮50 μmol/L組與氯胺酮100 μmol/L組的bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)量、cleaved-caspase3相對(duì)表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 對(duì)照組與不同濃度氯胺酮組體外凋亡相關(guān)蛋白bcl-2/Bax、cleaved-caspase3相對(duì)表達(dá)量的比較

1 對(duì)照組 2 氯胺酮50 μmol/L組 3 氯胺酮100 μmol/L組

2.2 兩組體外海馬神經(jīng)元樹(shù)突分支發(fā)育情況比較 氯胺酮組的樹(shù)突一級(jí)分支和樹(shù)突二級(jí)分支數(shù)的最大值分別為4.19±0.16、4.42±0.25，分別顯著小于對(duì)照組的6.42±0.21、7.06±0.36(P值均<0.01)。見(jiàn)圖3。

A 對(duì)照組 B 氯胺酮組

2.3 lncRNAs測(cè)序結(jié)果 與對(duì)照組比較，氯胺酮組lncRNAs相對(duì)表達(dá)量發(fā)生明顯改變(降低或升高)，兩組檢測(cè)各lncRNAs的表達(dá)情況見(jiàn)圖4。將氯胺酮組與對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)合表達(dá)倍數(shù)變化FC(橫軸)及統(tǒng)計(jì)偽發(fā)現(xiàn)率FDR(縱軸)，定義表達(dá)倍數(shù)變化>±1、偽發(fā)現(xiàn)率<0.05為顯著差異表達(dá)；與對(duì)照組比較，氯胺酮組中有67種lncRNAs顯著上調(diào)和7種lncRNAs顯著下調(diào)。見(jiàn)圖5。

1 對(duì)照組 2 氯胺酮組

圖5 差異lncRNAs表達(dá)量火山圖示意圖(藍(lán)色表示氯胺酮組表達(dá)下調(diào)的基因，灰色表示兩組間無(wú)顯著差異表達(dá)的基因，紅色表示氯胺酮組表達(dá)上調(diào)的基因)

2.4 GO分析和KEGG通路分析 對(duì)差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。通過(guò)不同層面(生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成)GO分析顯示，差異表達(dá)的lncRNAs主要分布于細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，可能參與了呼吸鏈的結(jié)構(gòu)等，見(jiàn)圖6A；主要的分子功能是通過(guò)與核酸或者金屬離子等結(jié)合實(shí)現(xiàn)，見(jiàn)圖6B；發(fā)揮的生物學(xué)作用主要為調(diào)控DNA模板的轉(zhuǎn)錄等，見(jiàn)圖6C。

A 細(xì)胞組成層面 B 分子功能層面 C 生物學(xué)作用層面

KEGG通路分析顯示，與差異表達(dá)的lncRNAs相關(guān)的主要通路包括氧化磷酸化、帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、剪接體、代謝通路、p53信號(hào)通路等，見(jiàn)圖7A；將各通路涉及的差異表達(dá)基因數(shù)量(面積)及P值(顏色)綜合分析，其中改變最顯著的通路為氧化磷酸化，見(jiàn)圖7B。

A 按P值大小列舉差異表達(dá)lncRNAs涉及的信號(hào)通路 B 按涉及基因數(shù)量及P值綜合列舉20個(gè)差異表達(dá)lncRNAs涉及的信號(hào)通路

2.5 兩組測(cè)序結(jié)果中7種lncRNAs相對(duì)表達(dá)量的比較 測(cè)序結(jié)果顯示，發(fā)育期小鼠多次給予氯胺酮處理后，其海馬組織中l(wèi)ncRNAs相對(duì)表達(dá)量發(fā)生顯著變化。從顯著上調(diào)或下調(diào)的lncRNAs中選取7種lncRNAs(TUG1、Six3os1、Snhg14、Snrpert、D930019O06Rik、4833438C02Rik、Gm33239)進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。氯胺酮組Six3os1相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，D930019O06Rik、4833438C02Rik相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)，均與測(cè)序結(jié)果一致；兩組間TUG1、Snhg14、Snrpert、Gm33239相對(duì)表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組測(cè)序結(jié)果中7種lncRNAs相對(duì)表達(dá)量的比較

對(duì)其中差異表達(dá)最顯著的lncRNA Six3os1進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本量后，氯胺酮組lncRNA Six3os1相對(duì)表達(dá)量為3.033±0.438，仍顯著高于對(duì)照組的1.256±0.339(P<0.01)。體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中，氯胺酮50 μmol/L組、100 μmol/L組lncRNASix3os1相對(duì)表達(dá)量分別為1.864±0.458、1.693±0.322，均顯著高于對(duì)照組的1.100±0.235(P值分別<0.01、0.05)。

3 討 論

以往對(duì)于麻醉藥物尤其是氯胺酮致神經(jīng)發(fā)育毒性的研究，大多聚焦于神經(jīng)凋亡的表型，探索引起凋亡的相關(guān)機(jī)制[4]，以及對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響，抑制神經(jīng)元的分化生長(zhǎng)[11]。也有一些對(duì)吸入麻醉藥和丙泊酚等的研究開(kāi)始關(guān)注神經(jīng)元分化生長(zhǎng)過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)麻醉藥可抑制樹(shù)突生長(zhǎng)和突觸形成，調(diào)控神經(jīng)元的可塑性[12]。本研究使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，氯胺酮組小鼠海馬組織中bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，cleaved-caspase3相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；并且在體外培養(yǎng)神經(jīng)元中，氯胺酮50 μmol/L組和氯胺酮100 μmol/L組的bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，cleaved-caspase3相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。上述體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多次或長(zhǎng)時(shí)間氯胺酮處理可促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡。此外，氯胺酮50 μmol/L組與氯胺酮100 μmol/L組間bcl-2/Bax、cleaved-caspase3相對(duì)表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故在后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)中均使用50 μmol/L氯胺酮處理。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮組的樹(shù)突一級(jí)分支和樹(shù)突二級(jí)分支數(shù)的最大值均顯著小于對(duì)照組，表明氯胺酮會(huì)導(dǎo)致發(fā)育期神經(jīng)元樹(shù)突分支數(shù)減少，阻礙樹(shù)突形態(tài)的發(fā)育。在神經(jīng)可塑性方面進(jìn)一步提供了氯胺酮可導(dǎo)致發(fā)育期神經(jīng)毒性作用的相關(guān)證據(jù)。

lncRNAs在大腦中顯著富集，并具有高度時(shí)空特異性。研究[13]發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在大腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化和增殖，參與神經(jīng)元生長(zhǎng)和突觸可塑性調(diào)節(jié)等。一項(xiàng)針對(duì)丙泊酚致神經(jīng)發(fā)育毒性的研究[6]發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可誘導(dǎo)新生大鼠大腦中159種lncRNAs顯著差異表達(dá)，主要功能與神經(jīng)退變相關(guān)，如鈣處理、凋亡、自噬和突觸發(fā)生等。本研究對(duì)發(fā)育期海馬組織在多次氯胺酮處理后進(jìn)行的lncRNAs測(cè)序結(jié)果顯示，氯胺酮誘導(dǎo)了67種lncRNAs顯著上調(diào)和7種lncRNAs顯著下調(diào)；其中經(jīng)過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證的7種lncRNAs中，僅Six3os1、Snhg14和TUG1 3種lncRNAs有文獻(xiàn)報(bào)道了其相關(guān)功能。Snhg14主要與神經(jīng)損傷有關(guān)，在帕金森病中有廣泛的研究。而TUG1主要與缺血、缺氧時(shí)神經(jīng)元的存活相關(guān)。

本研究對(duì)其中差異表達(dá)最顯著的lncRNA Six3os1進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本量后，氯胺酮組lncRNA Six3os1相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組。lncRNA Six3os1作為Six3基因的反義轉(zhuǎn)錄本之一，在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，參與神經(jīng)組織的分化[14]。2020年的一項(xiàng)研究[15]結(jié)果表明，Six3os1參與了抑郁樣行為的形成，在動(dòng)物模型中與海馬組織氧化應(yīng)激水平變化、海馬神經(jīng)元的凋亡相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，差異表達(dá)的lncRNAs涉及的主要通路為氧化磷酸化，提示氧化應(yīng)激可能在氯胺酮致發(fā)育期神經(jīng)毒性中發(fā)揮作用。Six3os1的上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致，且與氯胺酮多次處理后凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)變化的表型相關(guān)。已有研究證實(shí)，Six3os1的這一作用主要通過(guò)Six3os1/微RNA(miR)-511-3p/Fezf1/AKT軸實(shí)現(xiàn)。其中Six3os1的下游miR-511-3p在以往的研究中被認(rèn)為與神經(jīng)及突觸功能相關(guān)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的分化[16]；增加凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而誘導(dǎo)凋亡[17]；參與背外側(cè)前額葉皮質(zhì)中突觸可塑性的調(diào)節(jié)[18]。青春期的外界應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)大鼠前額葉皮層及海馬中miR-511表達(dá)下調(diào)，增加了認(rèn)知障礙的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[19]。Six3os1及其下游通路可能與氧化應(yīng)激、神經(jīng)凋亡、突觸可塑性調(diào)節(jié)等相關(guān)，這與本研究中多次氯胺酮處理后差異表達(dá)的lncRNAs主要富集在氧化應(yīng)激方面，以及氯胺酮可致神經(jīng)凋亡、抑制樹(shù)突發(fā)育等作用一致。因此推測(cè)，lncRNA Six3os1可能參與了氯胺酮致發(fā)育期神經(jīng)毒性作用。

本研究是以氯胺酮在發(fā)育期神經(jīng)毒性損傷中l(wèi)ncRNAs表達(dá)變化為基礎(chǔ)進(jìn)行的探索性研究。Six3os1對(duì)氯胺酮神經(jīng)毒性表型的直接作用，以及后續(xù)的下游機(jī)制尚待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，在體內(nèi)外模型中多次或長(zhǎng)時(shí)間給予氯胺酮會(huì)導(dǎo)致發(fā)育期海馬組織及神經(jīng)元凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)量增高、樹(shù)突分支數(shù)減少，產(chǎn)生顯著的發(fā)育期神經(jīng)毒性。經(jīng)多次氯胺酮處理后，發(fā)育期小鼠海馬組織中有67種lncRNAs顯著上調(diào)，7種lncRNAs顯著下調(diào)。經(jīng)驗(yàn)證，與神經(jīng)元凋亡及突觸可塑性相關(guān)的lncRNA Six3os1表達(dá)顯著增高，提示其可能參與了氯胺酮致發(fā)育期神經(jīng)毒性作用。