黃芪總黃酮通過調(diào)節(jié)Notch-Wnt 信號(hào)通路對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎模型大鼠炎癥反應(yīng)和成纖維細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化的影響

焦士軍，李巖，韋中陽，劉瑞端

（1.安陽市人民醫(yī)院骨外一科，河南 安陽 455000；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科，廣西 桂林 541001）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一種免疫介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，屬于脊柱關(guān)節(jié)病類，主要影響中軸骨骼，特別是骶髂關(guān)節(jié)和脊柱關(guān)節(jié)，其特征為軟骨硬化和骨質(zhì)增生導(dǎo)致的關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)慢性疼痛、活動(dòng)度降低，伴隨背部疼痛和僵硬，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)殘疾，且患虹膜炎、骨質(zhì)疏松和脊柱壓縮性骨折的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[1]。治療以控制炎癥、減輕癥狀、防止關(guān)節(jié)畸形為目的，包括物理治療、運(yùn)動(dòng)鍛煉和藥物治療等，其治療藥物主要包括非甾體類抗炎藥、柳氮磺胺吡啶等[2]，但多具有胃腸道反應(yīng)以及損傷肝、腎功能等副作用，且對(duì)骨骼改善作用有限[3]，因此尋找更為安全有效的天然藥物成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪具有多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)免疫的作用，被廣泛用于免疫相關(guān)疾病治療[4]。黃芪總黃酮是中藥黃芪的活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[5]，Yang等[6]發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮可通過抑制JNK/AKT/NFκB 信號(hào)通路減輕自身免疫性腦脊髓炎小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。本研究以AS大鼠為研究對(duì)象，探究黃芪總黃酮對(duì)其炎癥反應(yīng)和成纖維細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 雄性大鼠72 只，6 周齡，體質(zhì)量200～225 g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2017-0001。實(shí)驗(yàn)經(jīng)安陽市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合3R原則。

1.2 主要儀器、藥品、試劑

GL-23M 高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；HSA-M1812酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（深圳海思安生物技術(shù)有限公司）；DYCZ-24DH 雙板垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；牛軟骨蛋白聚糖、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司）；黃芪總黃酮（TFA：質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%，成都埃法生物科技有限公司）；柳氮磺胺吡啶腸溶片（上海福達(dá)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020840）；大鼠白細(xì)胞介素(Interleukin 6，IL-6)、IL-1β、IL-8 ELISA 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素（bone gla protein, BGP）、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（procollagen typeⅠN-terminal propeptide,PINP）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物研究所）；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin抗體（Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 AS模型建立及藥物干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按照潘金洋等[7]的方法復(fù)制AS 大鼠模型。制備免疫刺激制劑：將1 mg/mL 牛蛋白聚糖分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按1∶1比例冰上乳化混合。除空白對(duì)照組外，其余大鼠均腹腔注射牛蛋白聚糖-弗氏完全佐劑混合液0.2 mL，第14、28 天腹腔注射牛蛋白聚糖-弗氏不完全佐劑混合液0.2 mL，空白對(duì)照組同時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水-弗氏不完全佐劑混合液0.2 mL。

造模22 周，觀察大鼠是否出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動(dòng)受限和脊柱僵硬情況，判斷AS 模型是否成功建立后開始藥物干預(yù)，根據(jù)文獻(xiàn)[8]，黃芪總黃酮各劑量組分別給予25、50、100 mg/kg 灌胃，陽性藥物組給予柳氮磺胺吡啶825 mg/kg 灌胃，空白對(duì)照組和模型組予以等體積生理鹽水灌胃，1 次/d，持續(xù)28 d。

末次治療1 h 后，10%（φ）水合氯醛麻醉大鼠，取腹主動(dòng)脈血5 mL，靜置2 h后離心分離血清，分離大鼠脊柱，切下椎間盤并分離椎間盤上下的軟骨終板，PBS沖洗去除附著表面的血液、組織。脊柱軟骨和血清均保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 ELISA檢測(cè)血清、脊柱組織炎癥因子 脊柱軟骨勻漿裂解后，與血清分別按照試劑盒要求加入對(duì)應(yīng)試劑、孵育洗板后，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A450）。

1.3.3 顯色法檢測(cè)ALP、BGP、PINP 含量 按照試劑盒說明書要求提前制備工作液，96 孔板的待測(cè)樣本孔中加入5 μL 稀釋后的血清，50 μL 緩沖液和基質(zhì)液，37 ℃水浴15 min，加入150 μL 顯色劑，混勻后酶標(biāo)儀測(cè)定A520。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 脊柱軟骨勻漿裂解后，水浴變性，蛋白定量后上樣電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)模、顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶圖片，Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，采用SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪總黃酮對(duì)AS模型大鼠炎癥反應(yīng)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清、脊柱組織中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組血清、脊柱組織中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均顯著降低（P<0.05）。見表1、2。

表1 黃芪總黃酮對(duì)AS 模型大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-8 水平變化的影響Table 1 Effects of total flavonoids of astragalus on the levelsof serum IL-6,IL-1β and IL-8 in AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

表1 黃芪總黃酮對(duì)AS 模型大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-8 水平變化的影響Table 1 Effects of total flavonoids of astragalus on the levelsof serum IL-6,IL-1β and IL-8 in AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組黃芪總黃酮低劑量組中劑量組高劑量組陽性藥物組IL-669.70±11.41160.09±18.32*144.22±18.16101.04±16.42#91.07±12.70#77.72±13.38#IL-1β 90.70±21.53200.97±24.23*182.44±31.68142.03±33.16#121.26±23.33#106.93±21.87#IL-863.32±14.31163.24±29.83*145.19±19.31110.43±14.70#88.30±16.29#82.48±13.67#

2.2 黃芪總黃酮對(duì)AS模型大鼠ALP、BGP、PINP影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALP 活性、BGP 含量升高（P<0.05），PINP 含量降低（P<0.05）；與模型組比較，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組血清ALP 活性、BGP 含量降低（P<0.05），PINP含量升高（P<0.05）。見表3。

表2 黃芪總黃酮對(duì)AS 模型大鼠脊柱組織IL-6、IL-1β、IL-8水平變化的影響Table 2 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of IL-6,IL-1β and IL-8 in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

表2 黃芪總黃酮對(duì)AS 模型大鼠脊柱組織IL-6、IL-1β、IL-8水平變化的影響Table 2 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of IL-6,IL-1β and IL-8 in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組黃芪總黃酮低劑量組中劑量組高劑量組陽性藥物組IL-660.11±17.55127.98±22.58*111.69±23.8991.47±20.25#80.52±17.02#79.04±16.69#IL-1β 74.26±6.74149.52±9.56*137.53±14.59113.07±11.36#103.32±13.44#92.36±12.81#IL-8183.56±23.67328.77±21.52*294.35±28.33255.10±21.50#225.12±24.06#224.69±17.49#

表3 黃芪總黃酮對(duì)AS 模型大鼠血清ALP、BGP、PINP 變化的影響Table 3 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of serum ALP,BGP and PINP in AS rats (±s,n=12)

表3 黃芪總黃酮對(duì)AS 模型大鼠血清ALP、BGP、PINP 變化的影響Table 3 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of serum ALP,BGP and PINP in AS rats (±s,n=12)

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組黃芪總黃酮低劑量組中劑量組高劑量組陽性藥物組ρ(ALP)/（U·L-1）12.69±2.0424.11±3.26*22.73±0.9819.07±1.37#16.68±1.81#15.95±1.04#ρ(BGP)/（mg·L-1）1.11±0.211.84±0.25*1.67±0.261.54±0.24#1.44±0.22#1.40±0.22#ρ(PINP)/（ng·mL-1）47.41±4.0125.38±1.97*28.29±2.3034.70±2.39#40.52±3.12#42.73±2.83#

2.3 黃芪總黃酮對(duì)AS 模型大鼠成纖維細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠脊柱組織中BMP-2、TGF-β1 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）；與模型組比較，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組脊柱組織中BMP-2、TGF-β1 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。見圖1。

圖1 黃芪總黃酮對(duì)AS模型大鼠脊柱組織BMP-2、TGF-β1蛋白表達(dá)水平變化的影響Figure 1 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of BMP-2 and TGF-β1 in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

2.4 黃芪總黃酮對(duì)Notch-Wnt信號(hào)通路影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠脊柱組織中Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin 蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組脊柱組織中Notch1、Hes1、Wnt1、βcatenin蛋白表達(dá)水平均降低（P<0.05）。見圖2、3。

圖2 黃芪總黃酮對(duì)AS模型大鼠脊柱組織Notch信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平變化的影響Figure 2 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of Notch signaling-associated proteins in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

圖3 黃芪總黃酮對(duì)AS模型大鼠脊柱組織Wnt信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平變化的影響Figure 3 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of Wnt signaling-associated proteins in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

3 討論

關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)是AS 的主要特征，IL-1α、IL-1β基因位點(diǎn)的多態(tài)性與AS 易感性相關(guān)，NLRP3、ASC、caspase-1以及IL-1β在AS中呈高表達(dá)[9-10]。血清IL-6、IL-8水平可作為AS輔助診斷和疾病活動(dòng)度評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[11]。黃芪是臨床常用中藥，具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪總黃酮等主要活性成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[12]。馬歷歷等[13]發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮可減輕腦缺血再灌注造成的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)元凋亡。研究表明黃芪總黃酮通過調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎和免疫作用[14]。本研究中，經(jīng)黃芪總黃酮干預(yù)的AS 大鼠血清和脊椎組織中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均顯著降低，這與萬寶年等[15]的研究結(jié)果類似，表明黃芪總黃酮可減輕AS大鼠炎癥反應(yīng)。

脊柱和周圍關(guān)節(jié)的異位骨化也是AS 的重要疾病過程，在AS 晚期，軟骨逐漸被骨骼取代，出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直，最終導(dǎo)致殘疾。成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織的主要細(xì)胞類型之一，能產(chǎn)生富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)，在特定條件下可分化為成骨細(xì)胞，參與AS 異位骨化，多種骨生長因子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和骨代謝[16]。成骨細(xì)胞特異性分泌蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)礦化能力可準(zhǔn)確反映成骨分化程度，ALP 是一種與骨礦物質(zhì)形成相關(guān)的成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物，BGP 主要由成骨細(xì)胞合成，PINP 是反映骨代謝的指標(biāo)，在骨形成時(shí)釋放[17-18]。成纖維細(xì)胞在特定的細(xì)胞因子刺激下才能轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，BMP-2 是活性最高的骨形態(tài)發(fā)生蛋白，通常與TGF-β超家族一同誘導(dǎo)成骨分化。本研究中，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組大鼠血清ALP 活性降低，BGP 含量降低，PINP 含量升高，脊柱組織中BMP-2 和TGF-β1 蛋白表達(dá)均升高，這與葉松慶等[19]的研究結(jié)果一致，表明黃芪總黃酮可調(diào)控AS大鼠成纖維細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化。

Notch 信號(hào)通路在骨骼發(fā)育和代謝中起關(guān)鍵作用，也會(huì)影響骨折后骨重塑和再生過程。Notch 受體和配體在各種骨細(xì)胞中存在差異表達(dá)，功能也不相同，Notch1 通過抑制Runx2 抑制成骨細(xì)胞分化，Notch2 可刺激破骨細(xì)胞生成[20]。在AS 發(fā)生發(fā)展過程中，Notch 信號(hào)通路可與其他信號(hào)通路共同被激活，骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活會(huì)增加骨形成、骨礦物質(zhì)密度和松質(zhì)骨體積，β-catenin通過Notch 配體Jagged1 與Notch 鏈接，也有研究表明Notch 胞內(nèi)段穩(wěn)定了胞質(zhì)內(nèi)β-catenin，從而延長了Wnt 信號(hào)[21-22]。本研究中，黃芪總黃酮中、高劑量組和陽性藥物組大鼠脊柱組織中Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin 蛋白表達(dá)水平均降低，這與任磊等[23]的研究結(jié)果類似，表明黃芪總黃酮可通過抑制Notch-Wnt信號(hào)通路改善AS。

綜上所述，中、高劑量黃芪總黃酮可改善AS 大鼠炎癥反應(yīng)和成纖維細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化，這可能與其能抑制Notch-Wnt信號(hào)通路相關(guān)。