高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定五味子中8種木脂素含量

李曉霞，劉忠英，孫嚴(yán)彤，劉 曉，汪戎錦

（吉林大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室·吉林 長春·130021）

五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）屬木蘭科的一種藥用植物，多以其干燥成熟果實(shí)入藥[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，五味子果實(shí)、莖、根中含有包括木脂素類、多糖類、揮發(fā)油和有機(jī)酸等在內(nèi)的大量活性成分[2-5]，從而發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等疾病的調(diào)節(jié)作用，具有較強(qiáng)的藥用價(jià)值[6,7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，五味子具有神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)、肝臟保護(hù)、血糖和血脂調(diào)節(jié)、抗癌等藥理作用，且常應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟有關(guān)的疾病的臨床治療中[8-10]。

木脂素類化合物是五味子的主要活性成分[11]，約占五味子主要成分的8%[2]。其骨架結(jié)構(gòu)是兩個(gè)C6-C3單元通過位置8和8’之間的鍵連接而成的聯(lián)苯環(huán)辛烯類化合物[4]。聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素具有許多羥基和甲氧基，它們之間可能形成氫鍵并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性發(fā)生改變，從而發(fā)揮藥理作用[12]。

目前，雖然對(duì)五味子木脂素的化學(xué)成分研究較多，卻依然未將多種木脂素成分和總木脂素含量的分析方法納入五味子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究中。2020版《中國藥典》中僅以五味子醇甲作為含量測(cè)定指標(biāo)。因此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對(duì)五味子中8種木脂素成分進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化液相方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)合20批不同產(chǎn)地五味子木脂素含量的定量分析結(jié)果，為后續(xù)五味子及其炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。同時(shí)為其臨床應(yīng)用的安全性和有效性提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥材、試劑及儀器

五味子醇甲（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110857-201714）；五味子醇乙（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：180926）；當(dāng)歸?；昝仔罤（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：180927）；五味子酯甲（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111529-201706）；五味子酯乙（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：181209）；五味子甲素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110764-201714）；五味子乙素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110765-201512）；五味子丙素（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：181020）；甲醇（天津新通精細(xì)化工有限公司）；變色酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；硫酸（沈陽市派爾精細(xì)化工制品）；乙腈（默克股份公司）；磷酸（賽默飛科技有限公司）；Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore Inc）；紫外-可見分光光度計(jì)（美國Thermo，型號(hào)：G10S UV-Vis）；高效液相色譜儀（德國1260 Agilent Technologies）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。20批五味子的產(chǎn)地、批號(hào)等信息，詳見表1。

表1 20批五味子信息表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 供試品溶液制備

以序號(hào)為S1的吉林產(chǎn)五味子作為供試品進(jìn)行條件優(yōu)化及方法學(xué)考察。取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取甲醇20mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率20 kHz）20分鐘，取出，加甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得藥材的供試品溶液。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取取五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰基戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素對(duì)照品適量，加甲醇稀釋成每1 mL含五味子醇甲4.55 mg、五味子醇乙3.36 mg、當(dāng)歸?；昝仔罤 1.78 mg、五味子酯甲1.60 mg、五味子酯乙1.76 mg、五味子甲素3.00 mg、五味子乙素1.65 mg、五味子丙素1.60 mg的對(duì)照品溶液。

1.2.2 HPLC檢測(cè)條件

選用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫條件見表2。流速1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長：220 nm；進(jìn)樣量：10μL。

表2 梯度洗脫條件

1.2.3 方法學(xué)考察

通過專屬性實(shí)驗(yàn)、線性考察、精密度考察、重復(fù)性考察、穩(wěn)定性考察以及加樣回收率考察對(duì)優(yōu)化出的HPLC檢測(cè)條件進(jìn)行方法學(xué)考察，評(píng)價(jià)該方法的可行性。

1.2.4 不同產(chǎn)地五味子木脂素含量測(cè)定

精確稱量表1所示的20批不同產(chǎn)地的五味子藥材粉末，按照1.2.1進(jìn)行樣品制備，并采用1.2.2的條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，對(duì)20批不同產(chǎn)地五味子樣本的8種木脂素進(jìn)行定量分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 專屬性試驗(yàn)

按1.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液。分別取甲醇為空白對(duì)照溶液、混合對(duì)照品為對(duì)照品溶液、供試品溶液，采用1.2.2中條件進(jìn)行檢測(cè)。

從圖2中可以看出，五味子醇甲出峰時(shí)間在11.55 min附近；五味子醇乙出峰時(shí)間在15.36 min附近；當(dāng)歸?；昝仔罤出峰時(shí)間在22.30 min附近；五味子酯甲出峰時(shí)間在31.86 min附近；五味子酯乙出峰時(shí)間在32.96 min附近；五味子甲素出峰時(shí)間在44.32 min附近；五味子乙素出峰時(shí)間在48.51 min附近；五味子丙素出峰時(shí)間在50.44 min附近?？瞻兹軇?duì)各對(duì)照品及五味子樣品成分峰未出現(xiàn)干擾，表明該方法專屬性好，無雜峰干擾。

圖2 五味子專屬性考察

2.1.2 線性關(guān)系考察

精密吸取1.2.1項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液一定體積配制成混合對(duì)照品溶液，稀釋得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液。按1.2.2項(xiàng)下中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，即得。以各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照品溶液在一定濃度下均具有線性關(guān)系，其回歸方程，詳見表3。

表3 8種五味子木脂素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 精密度考察

用1.2.1項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，測(cè)定條件同1.2.2中的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，即得。結(jié)果表明，8種五味子木脂素的峰面積RSD值分別為0.52%、0.47%、0.49%、0.57%、0.52%、0.51%、0.47%、0.55%，均小于3.00%，表明該儀器精密度良好，符合定量分析要求。

2.1.4 重復(fù)性考察按1.2.1方法制備供試品溶液，測(cè)定條件同1.2.2中的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，即得。結(jié)果表明，8種五味子木脂素的峰面積RSD值分別為0.56%、0.46%、0.45%、0.42%、0.57%、0.32%、0.25%、2.87%，均小于3.00%，表明該方法重復(fù)性良好，符合定量分析要求。

2.1.5 穩(wěn)定性考察

按1.2.1方法制備供試品溶液，在制備后0、2、4、8、12、16、20、24 h時(shí)間點(diǎn)測(cè)定，測(cè)定條件同1.2.2中的色譜條件。

結(jié)果表明，8種五味子木脂素的峰面積RSD值分別為0.21%、0.30%、0.46%、0.83%、0.33%、0.84%、0.73%、2.73%，均小于3.00%，表明供五味子試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合定量分析要求。

2.1.6 重現(xiàn)性考察

按1.2.1方法制備同一批五味子供試品溶液6份，測(cè)定條件同1.2.2中的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，即得。結(jié)果表明，8種五味子木脂素的含量的RSD值分別為0.53%、0.73%、2.09%、1.26%、0.28%、0.32%、0.27%、2.31%，均小于3.00%，表明該方法重現(xiàn)性良好，符合定量分析要求。

2.1.7 加樣回收率考察

按1.2.1方法制備同一批五味子供試品溶液6份，測(cè)定條件同1.2.2中的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，即得。

由表4可得，8種五味子木脂素的加樣回收率在90～110%之間；RSD值均小于3.00%，表明該方法回收率良好，符合定量分析要求。

表4 加樣回收率考察

2.2 20批不同產(chǎn)地五味子木脂素成分含量測(cè)定

將20批不同產(chǎn)地的五味子中8種木脂素的含量進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表5。

表5 20批五味子木脂素成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

通過測(cè)定波長、色譜柱、流動(dòng)相種類、流速及柱溫條件的優(yōu)化從而篩選出五味子木脂素定量的最佳HPLC檢測(cè)條件。

3.1 測(cè)定波長的選擇

在DAD檢測(cè)器掃描下，得到五味子3D譜圖，由樣品和混合對(duì)照品溶液的全掃圖可得出五味子木脂素類化合物在220、250、280 nm處有最大吸收。五味子木脂素在220 nm下均具有很強(qiáng)的吸收，木脂素類成分出峰數(shù)目多，響應(yīng)值高，故選擇測(cè)定波長為220nm。

3.2 色譜柱的選擇

分別選用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱和Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，比較采用不同色譜柱時(shí)五味子木脂素的分離效果。通過分析樣品峰利用不同色譜柱進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的分離度、峰形等指標(biāo)，得出Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱分離度低、峰形差、且基線不穩(wěn)。采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱檢測(cè)時(shí)，五味子酯甲、五味子酯乙的分離度低。Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱檢測(cè)時(shí)，樣品峰的分離度及峰形較好，色譜峰分布均勻。最終選用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱進(jìn)行基于高效液相色譜法的木脂素定量研究。

3.3 流動(dòng)相種類的選擇

改變流動(dòng)相種類，比較選擇不同流動(dòng)相時(shí)，五味子木脂素的分離效果，從而選擇最佳的流動(dòng)相種類。通過分析樣品峰在不同條件下的分離度、峰形等指標(biāo)，得出乙腈（A）-0.5%磷酸水（B）、乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）為流動(dòng)相時(shí)，基線不平穩(wěn)。乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相時(shí)，五味子醇甲等待測(cè)成分具有較高分離度、峰形較好且基線平穩(wěn)。最終選用乙腈（A）-水（B）作為流動(dòng)相。

3.4 流速的選擇

改變流動(dòng)相流速，比較不同流速時(shí)，色譜圖中五味子木脂素的分離效果，從而選擇最優(yōu)流速。結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，4號(hào)峰分離度較低。流速為1.2 mL/min時(shí)，6號(hào)峰和7號(hào)峰的峰形不好，而流速為1.0 mL/min時(shí)各峰分離度高、峰形好，綜合分析樣品峰在不同條件的分離度、峰形，最終選擇流速為1.0 mL/min。

3.5 柱溫的選擇

改變色譜柱溫度，比較不同柱溫時(shí)，色譜圖中五味子木脂素的分離效果，從而選擇最優(yōu)檢測(cè)柱溫。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為35℃時(shí)，指標(biāo)峰分離度較差；柱溫為25℃時(shí)，1號(hào)峰分離度較低；柱溫為30℃時(shí)，各指標(biāo)峰的分離度及理論塔板數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，綜合分析樣品峰在不同條件的分離度及峰形，最終選擇在柱溫為30℃條件下進(jìn)行檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究建立了一種基于HPLC技術(shù)同時(shí)測(cè)定五味子中8種木脂素成分含量的檢測(cè)方法。通過實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，最終確定選用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長為220nm的含量測(cè)定方法。按2020年版《中國藥典》的有關(guān)規(guī)定，進(jìn)行一系列方法學(xué)考察，包括專屬性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和加樣回收率考察。并采用此方法對(duì)20批不同產(chǎn)地的五味子中8種木脂素進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，本文所建立的五味子木脂素成分含量測(cè)定方法靈敏、專屬性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好，加樣回收率在93.38%～103.87%（n=6）范圍，且RSD值均小于3.00%。本方法能夠同時(shí)檢測(cè)8種木脂素含量，色譜峰的分離度較高，具有較好的峰形，且操作簡(jiǎn)便易行。因此，可將此方法作為該藥材的指標(biāo)評(píng)價(jià)方法，并可為今后五味子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考標(biāo)準(zhǔn)及科學(xué)依據(jù)。

綜上，本研究建立的五味子指紋圖譜結(jié)合木脂素定量分析方法，能夠客觀地反映五味子內(nèi)在質(zhì)量的一致性與真實(shí)性，為制定五味子這一傳統(tǒng)中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與品質(zhì)評(píng)價(jià)模式提供重要的理論依據(jù)。