自然堆肥過程中可培養(yǎng)細菌群落多樣性的研究

王志慧，劉炳炎，黃彩霞，邱鵬瀅，潘宇睦，鄭文珺，王俊濤，蘆光新

(青海大學，青海 西寧 810016)

目前，隨著種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；⒓s化發(fā)展，以玉米、小麥、稻谷秸稈和畜禽糞便為主的農(nóng)業(yè)廢棄物大部分被隨意棄置，造成了有機肥資源巨大的浪費及較為嚴重的環(huán)境污染[1-3]。因此，如何合理處置農(nóng)業(yè)廢棄物以減少對環(huán)境的污染就顯得尤為重要。為響應國家綠色環(huán)保的發(fā)展政策，針對畜禽糞便的處理，好氧堆肥發(fā)酵是最有效可行的方式之一。高溫好氧堆肥是在合適的條件下利用多種微生物將固體有機物進行分解并逐步轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定腐殖質(zhì)的復雜生物學過程[4]。黃繼川等[5]利用盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，化肥與堆肥配施能夠改善土壤的酸度，提高養(yǎng)分的有效性，有利于作物的吸收。仝少偉等[6]采用啤酒污泥、牛糞和菇渣進行堆肥試驗表明，以含有活性小顆粒啤酒污泥堆肥對土壤呼吸和微生物生物量碳、氮、磷的影響最為明顯。堆肥中微生物數(shù)量及種群分布與多種因素有關(guān)[7]，了解堆肥過程中微生物變化對于縮短堆體腐熟時間具有重要意義。目前,關(guān)于自然堆肥過程中可培養(yǎng)細菌群落多樣性等方面的研究甚少。鑒于此，本研究將新鮮豬糞與油菜秸稈按照一定比例混勻自然堆肥，同時對自然堆肥中的溫度變化，可培養(yǎng)細菌的種類和多樣性進行分析，旨在探討自然堆肥過程中微生物的變化與發(fā)酵過程的關(guān)系，以期為后續(xù)堆肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

1.1.1 試驗材料 新鮮豬糞，油菜秸稈(將其粉碎至粒徑1～3 cm)。

1.1.2 試驗設(shè)計 將新鮮豬糞與油菜秸稈按照質(zhì)量比3∶1混勻，調(diào)節(jié)含水率為60%～70%，堆成底部直徑1 m、高0.7 m的圓錐形。C/N比控制在25∶1～30∶1。堆肥時間從6月1日至7月17日，整個堆肥階段為47 d。每4 d翻堆前取樣，樣品均從堆體內(nèi)部選取，從每堆上、中、下三個方向的縱切面進行取樣，混勻后裝入樣袋進行后續(xù)測定，共取樣12次。

1.2 細菌培養(yǎng)與測定

1.2.1 牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基制備 牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.2 可培養(yǎng)細菌的分離及純化鑒定 將1 g樣品加入至99 mL滅菌的蒸餾水中，配制成懸浮液(加入鏈霉素抑制非目標培養(yǎng)物)，利用常規(guī)培養(yǎng)手段進行細菌培養(yǎng)，期間觀察菌落形態(tài)，最后選取不同形態(tài)的群落進行純化、保存、鑒定。

1.2.3 微生物菌落測定 采用平板計數(shù)法進行菌數(shù)測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 溫度的測定 分別在每天上午10：00和下午15：00使用溫度計測量堆體上、中、下層的溫度，計算其平均值并做好記錄。本試驗溫度劃分為升溫階段:堆肥初期，溫度不斷上升；高溫階段:溫度上升至50 ℃以上,并保持一段時間，隨后又逐漸降低；降溫階段:高溫后溫度逐漸下降并穩(wěn)定；腐熟階段:處于堆肥后期，堆體的含水量降低，無刺激性氣味，堆體呈黑色或棕黑色。

1.3.2 菌種鑒定

(1)菌株基因組DNA的提取。用接種環(huán)蘸取經(jīng)純化的菌落放入液體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35 ℃、120 r/min 條件下振蕩，至培養(yǎng)基由澄清變?yōu)闇啙?，制備的菌液用于提取細菌DNA。菌株DNA采用Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒(編號：B518255-0050)進行提取，采用16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)進行擴增。PCR擴增條件：模板DNA 1 μL，上下游引物各2 μL(濃度10 μmol/L)，2X SanTaq PCR Mix 25 μL，ddH2O 20 μL；反應程序：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，57 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃、15 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

(2)菌株16S rDNA序列分析。將測序所得的序列用Contig Express軟件做序列拼接，在NCBI網(wǎng)站上進行比對，下載同源性高的序列及模式菌株的序列，選用MEGA 7.0軟件上的Clustal W功能進行序列比對，用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)為1 000。

1.4 群落結(jié)構(gòu)特征分析

細菌群落結(jié)構(gòu)特征用物種豐富度、相對多度、Simpson優(yōu)勢度、Shannon多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)等指標[8-10]表示：

物種豐富度(S)即群落中的物種數(shù)，指自然堆肥中樣品分離得到的細菌屬級物種數(shù)。

相對多度(Pi)指群落中某一物種的多度占所有物種的多度之和的百分比。

Pi=Ni/N

式中：N為物種總數(shù)；Ni為第i物種個體總數(shù)(本文以屬級為單位統(tǒng)計菌落數(shù))。

Simpson優(yōu)勢度(D指數(shù))在生態(tài)學中主要反映群落中最常見的物種，評估微生物群落豐富度。

Shannon多樣性指數(shù)(H指數(shù))在生態(tài)學中用來估算群落多樣性的高低。

式中：H′為物種的多樣性指數(shù)；S為物種(本文為屬級單位，下同)總數(shù)；Pi為第i種物種個體數(shù)占群落總個體數(shù)的比例。

Pielou均勻度指數(shù)(J指數(shù))在生態(tài)學中用來反映物種豐富度。

J=H′/lnS

式中：J為均勻度指數(shù)；H′為Shannon多樣性指數(shù)；S為物種種數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)整理，利用DPS6.55對數(shù)據(jù)進行ANOVA檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然堆肥中溫度的變化

由圖1可知，堆體整體的溫度變化趨勢大致為先升高后下降。1～2 d為升溫階段，堆體初始溫度為48.3 ℃，之后溫度不斷上升，第2天溫度升至51.5 ℃；3～27 d為高溫階段，隨著堆肥時間的延長，溫度持續(xù)升高，第8天堆體最高溫度達到最大值，為68.0 ℃，此階段平均溫度為59.5 ℃；28～39 d為降溫階段，該階段的溫度隨堆肥時間的持續(xù)開始下降，平均溫度為49.7 ℃；此后堆體進入腐熟階段，該階段因微生物的活動減少而導致溫度下降，平均溫度為32.9 ℃。在整個自然堆肥過程中溫度>50 ℃共有28 d，符合GB 7959—2012《糞便無害化衛(wèi)生標準》[11]。

圖1 自然堆肥發(fā)酵的溫度變化Fig.1 Temperature variation of natural composting fermentation

2.2 自然堆肥中可培養(yǎng)細菌菌落數(shù)及物種數(shù)

經(jīng)16S rDNA分子鑒定后，分離得到的可培養(yǎng)細菌種類共有16屬，細菌菌落數(shù)總計29 108個(表1)，其中微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)的菌落數(shù)最多，占總細菌菌落數(shù)的30.62%；其次為沙門氏菌(Salmonellabongori)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，分別占總細菌菌落數(shù)的20.32%和20.21%；其余13種細菌的菌落數(shù)較少，占總細菌菌落數(shù)的28.85%。

表1 自然堆肥中可培養(yǎng)細菌物種數(shù)量及所占比例

表2為自然堆肥中細菌數(shù)量及物種數(shù)的變化情況。由表可知，堆體初始溫度為48.3 ℃，此時堆體處于升溫階段(<50 ℃)，菌落數(shù)為4 738個，物種數(shù)有5種。3～27 d為高溫階段(>50 ℃)，其中第8天的溫度為68.0 ℃，第21天的溫度為57.0 ℃，物種數(shù)均有6種；第12天的溫度為53.7 ℃，細菌菌落數(shù)最多，達到5 776個。第28天之后，堆體溫度下降并開始腐熟，直至堆肥結(jié)束，溫度為29.2 ℃，細菌菌落數(shù)有2 075個，物種數(shù)有2種。由此可知，隨著堆肥時間及溫度的變化，堆體細菌菌落數(shù)和物種數(shù)逐漸減少。

表2 自然堆肥中細菌數(shù)量及物種數(shù)變化

2.3 自然堆肥中不同菌株(屬)優(yōu)勢度比較

某物種占整體物種的比例≥0.1為優(yōu)勢屬，0.01～0.1為常見屬，≤0.01為稀有屬[12]。由圖2可知，16個菌株中，微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物內(nèi)生賴氨酸芽孢桿菌等4種菌為優(yōu)勢種；弗氏大腸桿菌、消化鏈球菌、嗜酸酸桿菌、熱帶芽孢桿菌、米曲芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌等6種菌為稀有種；大腸桿菌、沙門氏菌、海洋芽孢桿菌、不動桿菌、嬰兒芽孢桿菌和花椒芽孢桿菌等6種菌為常見種。

圖2 自然堆肥中可培養(yǎng)細菌菌株優(yōu)勢度Fig.2 Dominance of culturable bacterial strain in natural composting

2.4 自然堆肥中可培養(yǎng)細菌群落多樣性分析

由表3可知，在自然堆肥過程中，微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌的Simpson優(yōu)勢度最大，顯著高于其他菌株(P<0.05)；沙門氏菌的Shannon指數(shù)、Pielou指數(shù)最大，且與其他菌株存在顯著差異(P<0.05)。微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌生長的最適溫度為30 ℃[13]，沙門氏菌為37 ℃[14]，且在前兩次樣品微生物培養(yǎng)中菌落數(shù)較多，分別為2 247個和1 063個(表4)，此時堆體處于高溫階段，大部分的嗜溫細菌(超過60%)能夠在堆肥的高溫期分離出來[15]。隨著堆體發(fā)酵時間的持續(xù)，整體上細菌菌落數(shù)逐漸減少，直至消失。由此可見，物種多樣性與堆肥溫度有關(guān)。

表3 自然堆肥中可培養(yǎng)細菌群落多樣性

表4 自然堆肥中樣品菌落數(shù)統(tǒng)計表

3 討論與結(jié)論

溫度是堆肥過程中非常重要的變量[16]。有研究表明，堆肥最佳溫度一般保持在50～60 ℃，此溫度范圍內(nèi)有利于殺死糞便中的病原菌。過低的堆肥溫度(<40 ℃)能夠抑制微生物活動，延長堆肥腐熟的時間；過高的堆肥溫度(>70 ℃)將對堆肥微生物產(chǎn)生有害影響[17]。堆肥溫度高于55 ℃必須保持3 d以上，才能殺死病原菌，達到無害化標準[18-19]。本研究的堆肥溫度連續(xù)有9 d高于55 ℃，堆肥內(nèi)的病原菌已被有效殺死。C/N是有機肥發(fā)酵過程中的一個關(guān)鍵因素，不合適的C/N會影響微生物的生長、有機物的分解和發(fā)酵時長[20]。黃國鋒等[21]提出堆肥起始的C/N在25∶1～30∶1為堆肥的最佳條件。本試驗中自然堆肥的C/N控制在25∶1～30∶1，且高溫階段維持在50～60 ℃的時間較長，說明自然堆肥的發(fā)酵效果良好。

在發(fā)酵過程中，細菌可以將堆肥物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為有機物并伴隨熱量的產(chǎn)生。在本次堆肥試驗的發(fā)酵過程中，細菌數(shù)量整體呈“下降—升高—下降”的趨勢，在高溫階段菌落數(shù)與物種數(shù)增加，這與劉佳等[22]的研究結(jié)果不一致，可能是因為試驗材料和環(huán)境不同導致微生物群落變化存在差異。本試驗在前中期的時候，細菌數(shù)量急速上升，溫度也不斷上升，最高溫度達到68 ℃。這是由于升溫階段堆肥內(nèi)的微生物可以利用現(xiàn)有的營養(yǎng)物質(zhì)進行快速繁殖，使菌群數(shù)量急速增加；微生物因活動而產(chǎn)生熱量，使得溫度隨著發(fā)酵時間的延長逐漸升高。另外，在自然堆肥過程中發(fā)現(xiàn)，升溫階段微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌和沙門氏菌占主導地位，這可能是由于嗜溫細菌在高溫階段形成了微菌落的原因。隨著嗜熱細菌活性的減弱，堆肥的溫度開始降低，嗜溫細菌又開始占主導地位[14]。

綜上可知，本研究通過對自然堆肥過程中可培養(yǎng)細菌群落多樣性的研究，發(fā)現(xiàn)在堆肥發(fā)酵過程中，前中期階段細菌的主要優(yōu)勢菌以微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌屬、沙門氏菌屬和解淀粉芽孢桿菌屬為主；隨著發(fā)酵時間的延長，微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌屬、沙門氏菌屬和解淀粉芽孢桿菌屬的數(shù)量逐漸減少甚至消失；堆肥后期以芽孢桿菌屬(枯草芽孢桿菌屬和花椒芽孢桿菌屬)為主。本研究結(jié)果為自然堆肥可培養(yǎng)細菌的后續(xù)菌落特征研究提供一定的理論參考。