小麥條銹菌實時熒光定量PCR檢測方法的建立

劉耀霞，張學飛，閆佳會，姚 強，郭青云

(青海大學農(nóng)林科學院，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海 西寧 810016)

小麥是世界三大主要糧食作物之一，由條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麥條銹病是影響小麥優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要病害，小麥條銹病大流行時會造成一半以上產(chǎn)量損失甚至絕產(chǎn)[1-3]。因此，掌握小麥條銹菌的流行與傳播并準確估計小麥潛育期葉片菌源量是綜合防控條銹病的重要措施[4-6]。國內(nèi)外學者利用實時熒光定量PCR(Quantitivate PCR，qPCR)技術(shù)快速檢測馬鈴薯酸瘡痂鏈霉菌[7]、黃瓜棒孢葉斑病菌[8]、葡萄霜霉病[9]、楊樹枯萎病菌[10]、柑橘黃龍病[11]、葡萄蠶豆萎蔫病毒[12]、番茄細菌性斑點病菌[13]、油菜菌核病[14]及小麥條銹病等病害。初炳瑤等[15]利用qPCR技術(shù)檢測了四川省多個小麥品系抗條銹病的差異?？仔掠畹萚16]利用qPCR技術(shù)定量檢測天水市秦州區(qū)、隴南市禮縣及平?jīng)鍪星f浪縣標記的小麥條銹菌越冬病株的菌源量。黃雪玲等[17]和Ma等[18]利用該技術(shù)得出小麥條銹菌基因表達水平的最適內(nèi)參基因。潘娟娟等[19]、Fraaije等[20]利用該技術(shù)研究了小麥條銹菌生理小種CYR32潛育期的條銹菌菌源量。近年來，小麥條銹菌生理小種CYR34的流行范圍逐年擴大，逐漸上升為優(yōu)勢小種[21]，所以研究該生理小種潛育期菌源量有重要意義。本試驗基于小麥條銹菌生理小種CYR34和小麥條銹菌延伸因子EF1引物，利用qPCR技術(shù)檢測小麥條銹菌在小麥潛育期葉片菌源量，為早期預防大面積小麥條銹病提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(1)供試病原菌。小麥條銹菌生理小種CYR34(標樣采自青海貴德、循化等地區(qū)，經(jīng)單孢子堆分離和毒性鑒定得到生理小種CYR34)、小麥白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)和小麥赤霉菌(Fusariumgraminarum)。以上病原菌均由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室提供。

(2)寄主植物。高感條銹病品種銘賢169，由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室提供。

1.2 試驗試劑與儀器

(1)試驗試劑。CTAB(100 mL 1 mol/L Tris HCl，pH 8.0，280 mL 5 mol/L NaCl，40 mL 0.5 mol/L EDTA，580 mL ddH2O)；DNA提取液(氯仿：異戎醇=24∶1)；異丙醇；75%乙醇；1 X TE溶液；EF1引物合成于上海生工生物工程股份有限公司。DL 500 DNA Marker、TaqTM、TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ均購買于TaKaRa公司。

(2)試驗儀器。DK-600A型電熱恒溫水槽，電子天平(1/1 000)；NanoDropTM One超微量紫外分光光度計；eppendorf移液器；高速冷凍離心機ST 16R；Bio-Rad Thermal Cycler PCR儀；渦旋混合儀G560E；電泳儀DYCP-31DN；凝膠成像系統(tǒng)Champ Gel 6000；光照培養(yǎng)箱MLR-352H-PC；實時熒光定量PCR儀7500；TissueLyserⅡ組織破碎儀等。

1.3 試驗方法

(1)樣品DNA提取。采集的小麥條銹菌標樣在室內(nèi)接種擴繁，擴繁完成后進行毒性鑒定[22]。將條銹菌及接種后的葉片保存在冰箱用于提取DNA。利用分光光度計檢測提取到的DNA濃度，并在-80℃冰箱中冷凍保存。

表1 小麥條銹菌引物

(2)引物篩選及特異性檢測。所用小麥條銹菌引物見表1，EF1引物是小麥條銹菌延伸因子[23]，PS1、PS2是利用條銹菌β-微管蛋白1基因(基因登錄號：HM067998.1)序列設計的引物。常規(guī)PCR 25 μL反應體系為12.5 μL Ex Taq，各0.5 μL 10 μmol/L正反引物，0.5 μL模板DNA，11 μL ddH2O。常規(guī)PCR反應程序見表2。3%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)后用凝膠成像觀察條帶。qPCR 25 μL反應體系為12.5 μL TBGreen，各1 μL 10 μmol/L正反引物，0.4 μL ROX，1 μL模板DNA，9.1 μL ddH2O。qPCR反應程序見表3。觀察電泳條帶及熔解曲線，從而篩選引物。

(3)靈敏度檢測。小麥條銹菌生理小種CYR34 DNA的原溶液濃度為1.05×108fg/μL，稀釋后得到濃度分別為1.05×107、1.05×106、1.05×105、1.05×104、1.05×103、1.05×102和10.5 fg/μL的溶液。通過EF1引物進行常規(guī)PCR擴增和qPCR擴增，根據(jù)有無擴增片段和熒光信號值評價EF1引物對小麥條銹菌DNA的靈敏度。

(4)qPCR標準曲線的繪制。將小麥條銹菌生理小種CYR34的DNA初始濃度按10倍梯度稀釋，并利用qPCR儀進行擴增后得到相應的CT值(每個反應管內(nèi)熒光信號達到設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，在Excel中建立qPCR標準曲線。

(5)樣品驗證檢測。在光照培養(yǎng)箱MLR-352H-PC中栽培24盆銘賢169，每盆種10棵小麥幼苗。待小麥生長至2葉期，將條銹菌孢子懸浮液涂抹在第1片葉片正面，在接種室黑暗培養(yǎng)24 h后移至溫室，培養(yǎng)溫度為10～15 ℃。每隔24 h采樣1次，直至出現(xiàn)病斑(第8天后)，每次取約100 mg葉片，每個樣品重復3次。將采集的樣品保存在-80 ℃冰箱中。提取DNA前將葉片表面清洗干凈，再利用CTAB方法提取小麥葉片gDNA，并進行qPCR擴增。應用所建立的qPCR標準曲線計算小麥潛育期葉片中的條銹菌菌源量。

2 結(jié)果與分析

2.1特異性引物篩選分別利用三組引物進行常規(guī)PCR擴增和qPCR擴增后，特異性引物篩選如圖1，從圖中可以看出EF1引物擴增出了單一的目的條。引物qPCR熔解曲線如圖2所示，由圖2可知引物EF1熔解曲線為單一的產(chǎn)物峰，而引物PS1和PS2擴增出現(xiàn)了多條片段，熔解曲線出現(xiàn)雜峰，產(chǎn)生其他非特異性熒光。因此，選用小麥條銹菌延伸因子EF1為本試驗的引物。

圖1 特異性引物篩選 Fig.1 Screening of specific primer

圖2 引物qPCR 熔解曲線Fig.2 qPCR melting curves of primer

2.2引物特異性檢驗以ddH2O作為對照，利用EF1引物對小麥條銹菌、小麥白粉菌及小麥赤霉菌基因組DNA進行常規(guī)PCR擴增。EF1引物特異性檢測結(jié)果如圖3所示，由圖3可知小麥條銹菌擴增出了特異性目的片段243 bp，陰性對照及其他病原菌均未擴增出片段。EF1引物qPCR熔解曲線如圖4所示，從圖中可以看出，進行qPCR擴增后熔解曲線未出現(xiàn)雜峰，擴增產(chǎn)物單一。說明EF1引物特異性良好，可以用于小麥條銹菌特異性檢測。

圖3 EF1引物特異性檢測結(jié)果Fig.3 Specificity detection of primer EF1

圖4 EF1引物qPCR 熔解曲線Fig.4 qPCR melting curve of primer EF1

2.3引物靈敏度檢測將小麥條銹菌gDNA的濃度進行梯度稀釋后，分別用常規(guī)PCR和qPCR進行擴增。EF1引物對常規(guī)PCR有擴增，檢測到最低條銹菌菌源量為1.05×104fg/μL，低于該濃度條銹菌無擴增條帶(圖5)。qPCR檢測到的濃度最低值為1.05×102fg/μL，即qPCR檢測靈敏度是常規(guī)PCR靈敏度的100倍(圖6)。

圖5 EF1引物常規(guī)PCR 靈敏度檢測Fig.5 Sensitivity detection of ordinary PCR of primer EF1

圖6 qPCR 靈敏度檢測Fig.6 Sensitivity detection of qPCR

2.4qPCR標準曲線的建立將小麥條銹菌DNA的濃度進行10倍稀釋，以不同倍數(shù)梯度稀釋的gDNA為模板構(gòu)建qPCR標準曲線。以循環(huán)數(shù)為Y軸，基因組DNA濃度的對數(shù)為X軸，繪制qPCR標準曲線后得出回歸方程。小麥條銹菌標準曲線如圖7所示，DNA拷貝數(shù)與CT值之間存在良好的線性關系：Y=-1.788 5x+27.681(R2=0.981 9，P<0.001)。

圖7 小麥條銹菌標準曲線Fig.7 Standard curve of P.striiformis f. sp. tritici

圖8 接種后小麥潛育期葉片菌源量Fig.8 Bacteria source quantity in wheat leaves during the incubation period after inoculation

2.5小麥潛育期葉片菌源量檢測取接種后的小麥葉片進行qPCR檢測，其菌源量如圖8所示。接種后第1天條銹菌菌源量為0.01 ng，菌源量隨著接種天數(shù)的增加不斷增多；第9天葉片表面出現(xiàn)零星的夏孢子，停止取樣，增長趨勢呈指數(shù)型：Y=0.011e0.839x(R2=0.964 2)，其中x是接種天數(shù)，Y是接種后的菌源量。接種后第8天檢測到小麥葉片中的條銹菌菌源量達到約5.5 ng。

3 討論與結(jié)論

通過qPCR技術(shù)建立小麥潛育期條銹菌菌源量檢測體系可為預防小麥條銹病提供理論依據(jù)。Devadas等[24]與Wang等[25]利用遙感技術(shù)、紅外光譜分析等技術(shù)檢測到小麥條銹菌。潘娟娟等[19]通過應用特異性引物betaf/betar建立了qPCR檢測體系，定量檢測小麥葉片接種條銹菌后組織內(nèi)的DNA變化，可以有效預測條銹菌在一定時間內(nèi)的菌源量變化。

本試驗基于小麥條銹菌生理小種CYR34和小麥條銹菌延伸因子EF1引物，利用qPCR技術(shù)快速準確檢測小麥潛育期條銹菌菌源量，得出以下結(jié)論：(1)本研究建立了qPCR標準曲線，DNA拷貝數(shù)與CT值存在良好的線性關系，即Y=-1.788 5x+27.681(R2=0.981 9，P<0.001)。(2)本研究構(gòu)建的qPCR檢測體系的靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，能夠更早、更及時地檢測病害。(3)在小麥葉片接種條銹菌后第1天應用qPCR檢測體系檢測到條銹菌，且第8天檢測到小麥葉片中的條銹菌菌源量約為5.5 ng。