基于PI3K/Akt/Caspase-9信號(hào)通路研究嚴(yán)氏強(qiáng)心飲對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

朱思行，嚴(yán)世蕓，徐 燕，秦 嫣，陳麗云*，賈美君*

1上海中醫(yī)藥大學(xué)科技人文研究院，上海 201203；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；3上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071

心力衰竭（heart failure，HF）是心室舒張或收縮功能受損，以動(dòng)脈缺血和/或靜脈淤血為主要特征的一組臨床綜合征，常常是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致的，是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿［1］，常見(jiàn)于各種心臟疾病的危重期或晚期階段。近年來(lái)，HF的患病率、病死率和再住院率居高不下［2］，嚴(yán)重危害人們的身心健康。細(xì)胞凋亡是各種生物體內(nèi)較常見(jiàn)的細(xì)胞死亡方式，心肌細(xì)胞數(shù)量減少是導(dǎo)致心肌功能障礙的決定性因素［3］。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、合成、維持、凋亡等方面都起著重要的作用，研究表明，通過(guò)對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，減緩心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程是控制HF的有效途徑［4-5］。

HF屬于中醫(yī)“心水”“心痹”“心悸”等范疇，其病機(jī)關(guān)鍵為陽(yáng)虛不化、水飲內(nèi)停、痰濁瘀阻等，溫陽(yáng)利水是HF的主要治法之一［6］。中醫(yī)藥在心臟治療和康復(fù)方面療效顯著［7］，有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。嚴(yán)氏強(qiáng)心飲是國(guó)醫(yī)大師嚴(yán)世蕓教授創(chuàng)制的治療HF的經(jīng)驗(yàn)方和基礎(chǔ)方，具有補(bǔ)益心腎、溫陽(yáng)利水的作用。前期臨床研究證明，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲能夠改善HF患者的臨床癥狀，提高其生活質(zhì)量［8-9］。但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。基于此，本研究擬構(gòu)建阿霉素誘導(dǎo)的HF大鼠模型，觀察嚴(yán)氏強(qiáng)心飲對(duì)HF大鼠的干預(yù)效果，并探討其作用機(jī)制是否與PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，為嚴(yán)氏強(qiáng)心飲的后續(xù)臨床應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量約200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK2019-0001）。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按體質(zhì)量由高到低進(jìn)行編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組和培哚普利組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)藥物為嚴(yán)氏強(qiáng)心飲水煎液。嚴(yán)氏強(qiáng)心飲（制附子12 g，茯苓15 g，豬苓15 g，白術(shù)12 g，白芍12 g，淫羊藿20 g，補(bǔ)骨脂12 g，鹿角9 g）采用傳統(tǒng)方法水煎并水浴濃縮，分別配制成含生藥0.432 5、0.865、1.73 g/mL的提取液。所用中藥均購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房。

1.3 主要試劑與設(shè)備

1.3.1 主要試劑 阿霉素（阿拉丁控股集團(tuán)有限公司，A183027）；培哚普利（MedChemExpress公司，HY-B0130）；異氟烷（上海玉研科技有限公司，S10010533）；BNP ELISA試劑盒（CUSABIO公司，CSB-E07972r）；TUNEL試劑盒（Roche公司，116848 17910）；DAPI試劑盒（Sigma公司，D9542）；PI3K抗體（Abcam公司，ab191606）；Akt抗體（4060T）、Caspase-9抗體（9507s）、Caspase-3抗體（9664T）均購(gòu)自CST公司；Bax抗體（ab32503）、Bcl-2抗體（ab59348）均購(gòu)自Abcam公司。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)（VisualSonics公司，型號(hào)：Vevo2100）；激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，型號(hào)：TCSSPE）；電泳儀（BIORAD公司，型號(hào)：165-8000）。

1.4 模型制備及干預(yù)方法

在避光條件下，用0.9%NaCl溶液將阿霉素粉針配成濃度1 mg/mL的溶液（避光），培哚普利配成濃度0.4 mg/mL的溶液。參照相關(guān)文獻(xiàn)方法［10］，除正常組外，其余各組大鼠每周按2 mg/（kg·d）的劑量給予尾靜脈注射阿霉素溶液進(jìn)行造模，共注射6周；正常組尾靜脈注射等容積0.9%NaCl溶液。同時(shí)，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低、中、高劑量組分別給予低、中、高劑量嚴(yán)氏強(qiáng)心飲灌胃［11］，各組含生藥分別為4.325、8.65、17.3 g/（kg·d）；培哚普利組予培哚普利溶液灌胃，劑量為4 mg/（kg·d）。灌胃劑量以10 mL/（kg·d）計(jì)算，正常組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠心臟超聲檢測(cè) 末次給藥1 d后，將大鼠麻醉及心臟部位脫毛處理后，采用超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)（圖像深度調(diào)為2 cm，頻率為21 MHz）對(duì)大鼠進(jìn)行M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。主要測(cè)量指標(biāo)包括左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension diastole，LVIDd）及左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension systole，LVIDs）。

1.5.2 大鼠血清B型鈉尿肽含量檢測(cè) 心臟超聲檢查完畢后，對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血。血液靜置2 h后離心（4℃，3 000 r/min，10 min）。利用ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清B型鈉尿肽（B-typenatriuretic peptide，BNP）含量。操作步驟均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測(cè)樣品孔，每孔加入相應(yīng)的試劑100μL，封板后置37℃溫育2 h后，每孔先后加入100μL生物素抗體、100μL HRPavidin、90μL TMB，并置37℃孵育，避光顯色后加入終止液終止反應(yīng)，測(cè)量各孔的光密度值（optical density，OD）。

1.5.3 心肌組織病理學(xué)檢測(cè) 用異氟烷麻醉大鼠后，在其膈肌處剪一橫行切口，充分暴露胸腔，分離心包后迅速摘取大鼠心臟，用4℃克氏液沖洗干凈后置于4℃克氏液中，于顯微鏡下快速分離主動(dòng)脈和上、下腔靜脈以及肺動(dòng)脈、肺靜脈，并用濾紙吸干表面水分。切取一部分左室心肌組織置入脫水盒內(nèi)，用自動(dòng)組織脫水機(jī)常規(guī)梯度脫水、透明、浸蠟后進(jìn)行人工石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)切片。將處理好的切片用4%多聚甲醛處理（室溫）30 min后，置于二甲苯中脫蠟2次，5 min/次；再置于無(wú)水乙醇中浸泡5 min，95%乙醇中浸泡5 min，70%乙醇中浸泡5 min；然后用0.5%Txiton X-100處理（室溫）5 min后，加入配置好的TUNEL標(biāo)記液，37℃避光孵育60 min，加入DAPI染色液，孵育5 min；最后用抗熒光淬滅封片液封片，待干后用激光共聚焦顯微鏡，調(diào)至×200倍鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況并拍照，采用Image J軟件計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)＝凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌總細(xì)胞數(shù)×100%

1.5.4 PI3K/Akt/Caspase-9信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平及凋亡因子檢測(cè) 將待測(cè)的大鼠左室心肌組織放置于培養(yǎng)皿中，加入1×RIPA 100μL的裂解液，待充分溶解后提取蛋白，并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取15μg總蛋白進(jìn)行凝膠電泳（電壓分別為80、120 V），再通過(guò)半干轉(zhuǎn)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min；用含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h后，孵于1∶1 000稀釋好的一抗，4℃過(guò)夜。洗膜后加入以1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h后，將膜放入發(fā)光成像儀中，滴加發(fā)光試劑曝光。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)PI3K、Akt、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用校正t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6組大鼠存活情況

在造模及給藥過(guò)程中，共有7只接受阿霉素注射的大鼠死亡，其中模型組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組和培哚普利組分別死亡2、1、1、1、2只。最終納入實(shí)驗(yàn)研究大鼠正常組、模型組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組、嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組和培哚普利組分別為10、8、9、9、9、8只。

2.2 6組心臟超聲檢測(cè)結(jié)果比較

M模式下大鼠心臟超聲結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組左室前壁運(yùn)動(dòng)波形不明顯，接近直線運(yùn)動(dòng)，且LVEF、LVFS明顯下降（P＜0.05），LVIDd、LVIDs明顯升高（P＜0.05），左室明顯擴(kuò)大，收縮能力減弱，提示HF模型復(fù)制成功。給予不同劑量嚴(yán)氏強(qiáng)心飲干預(yù)后，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低、中、高劑量組左室前壁運(yùn)動(dòng)波形的幅度較模型組均有不同程度的增長(zhǎng)，且隨著給藥濃度升高，LVEF、LVFS逐漸升高（P＜0.05），LVIDd僅在嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組降低（P＜0.05）。與模型組比較，LVIDs在嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中、高劑量組均明顯降低（P＜0.05），嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組降低最明顯（P＜0.05）。與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組比較，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組LVIDd、LVIDs差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

2.3 6組血清BNP含量比較

與正常組比較，模型組BNP含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低、中、高劑量組BNP含量均明顯降低，且隨著給藥濃度的升高，BNP含量呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 6組大鼠心臟超聲檢測(cè)圖Figure 1 Cardiac ultrasound patterns in six groups

表1 6組心臟超聲檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of cardiac ultrasound in six groups（±s）

表1 6組心臟超聲檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of cardiac ultrasound in six groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the mediumdose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8 LVEF/%84.28±1.76 30.07±0.781）35.19±1.162）40.99±1.22）3）48.83±2.372）3）4）68.75±1.372）LVFS/%58.97±5.81 16.65±2.981）18.6±1.88 33.57±11.212）3）30.41±6.752）3）4）39.7±1.022）LVIDd/mm 184.13±47.07 380.82±48.271）406.59±101.79 248.11±28.482）3）329.58±17.86 278.07±37.072）LVIDs/mm 48.84±28.45 255.95±49.841）253.73±50.56 100.61±36.342）3）145.98±29.972）87.25±14.142）

表2 6組大鼠血清BNP含量比較（±s） pg/mLTable 2 Comparison of serum BNP content in six groups（±s） pg/mL

表2 6組大鼠血清BNP含量比較（±s） pg/mLTable 2 Comparison of serum BNP content in six groups（±s） pg/mL

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the medium dose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8 BNP 172.36±9.01 348.02±11.991）313.55±9.602）272.55±9.652）3）207.06±10.492）3）4）183.08±8.672）

2.4 6組心肌組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較

心肌組織細(xì)胞由DAPI＋TUNEL雙染色后，兩者圖像經(jīng)軟件融合后得到merge圖片，其中陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光。圖像中的心肌細(xì)胞凋亡免疫熒光結(jié)果顯示：正常組細(xì)胞基本沒(méi)有凋亡，幾乎檢測(cè)不到陽(yáng)性信號(hào)；經(jīng)阿霉素造模后，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡較正常組明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，培哚普利組細(xì)胞凋亡數(shù)最少（P＜0.05），隨著嚴(yán)氏強(qiáng)心飲濃度的升高，其細(xì)胞凋亡數(shù)量呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

表3 6組心肌細(xì)胞凋亡情況比較（±s） %Table 3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis in six groups（±s） %

表3 6組心肌細(xì)胞凋亡情況比較（±s） %Table 3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis in six groups（±s） %

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the medium dose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)0.01±0.01 58.93±3.461）52.13±1.36 35.87±2.482）3）15.40±2.162）3）4）9.53±0.702）

圖2 6組心肌組織病理學(xué)檢測(cè)圖（×200）Figure 2 Myocardial histopathology figure in six groups(×200)

2.5 6組PI3K/Akt/Caspase-9信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較

與正常組相比，模型組PI3K、Akt蛋白表達(dá)降低，Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)升高。與模型組比較，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低、中、高劑量組PI3K、Akt蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），且隨著給藥濃度升高而逐漸升高（P＜0.05），嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低、中、高劑量組Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），且隨著給藥濃度升高而逐漸降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 6組PI3K/Akt/Caspase-9信號(hào)通路蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of PI3K,Akt,Caspase-9 signaling pathway protein in six groups

表4 6組PI3K、Akt、Caspase-9信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（±s）Table 4 Comparison of expression of PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway protein in six groups（±s）

表4 6組PI3K、Akt、Caspase-9信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（±s）Table 4 Comparison of expression of PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway protein in six groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the mediumdose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8 PI3K 1.50±0.25 0.39±0.031）0.74±0.112）1.03±0.192）3）1.15±0.082）3）4）1.26±0.222）Akt 1.49±0.41 0.74±0.41）0.95±0.382）1.09±0.362）3）1.27±0.372）3）4）1.34±0.392）Caspase-9 0.42±0.05 1.00±0.091）0.89±0.142）0.77±0.112）3）0.65±0.072）3）4）0.51±0.082）Caspase-3 0.41±0.05 1.01±0.231）0.87±0.242）0.73±0.162）3）0.56±0.122）3）4）0.46±0.072）

2.6 6組心肌組織凋亡因子比較

與正常組比較，模型組Bcl-2含量、Bcl-2/Bax比值均明顯降低，而B(niǎo)ax含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低、中、高劑量組Bcl-2含量明顯升高（P＜0.05），隨著嚴(yán)氏強(qiáng)心飲濃度的升高而逐漸增多（P＜0.05）；嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中、高劑量組Bax含量隨著嚴(yán)氏強(qiáng)心飲濃度的增加而逐漸下降（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2/Bax比值隨著給藥濃度升高而逐漸提高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表5。

3 討 論

3.1 嚴(yán)氏強(qiáng)心飲可改善HF大鼠心臟功能，減少心肌細(xì)胞凋亡

圖4 6組心肌組織凋亡因子檢測(cè)結(jié)果Figure 4 Myocardial tissue apoptosisfactor assay results in six groups

經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖是評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和功能的首選方法，LVEF可反映左心室收縮功能［11-12］。本研究結(jié)果顯示，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低、中、高劑量組LVEF、LVFS逐漸升高，且嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組改善效果更明顯；嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組LVIDd降低，與模型組比較，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中、高劑量組LVIDs均明顯降低，這提示嚴(yán)氏強(qiáng)心飲可改善HF大鼠心臟功能。BNP主要由心室肌合成，當(dāng)心臟負(fù)荷增大或心室擴(kuò)大時(shí)，心肌細(xì)胞受牽拉而合成并釋放BNP入血增加，血漿BNP含量升高，并與心功能損傷的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)，故血清BNP的檢測(cè)被推薦用于HF篩查、診斷和鑒別診斷、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估［13-14］。本研究結(jié)果顯示，HF大鼠血清BNP含量、心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量隨著嚴(yán)氏強(qiáng)心飲濃度的升高而逐漸降低，這提示嚴(yán)氏強(qiáng)心飲能夠有效抑制HF大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，且呈一定劑量依賴性，提高HF大鼠的心臟功能。

表5 6組心肌組織凋亡因子比較（±s）Table 5 Comparison of myocardial tissue apoptosis factor in six groups（±s）

表5 6組心肌組織凋亡因子比較（±s）Table 5 Comparison of myocardial tissue apoptosis factor in six groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the mediumdose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲低劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲中劑量組嚴(yán)氏強(qiáng)心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8 Bcl-2 1.02±0.13 0.27±0.061）0.45±0.112）0.66±0.112）3）0.86±0.102）3）4）0.89±0.132）Bax 0.77±0.11 1.58±0.041）1.50±0.10 1.31±0.042）3）1.10±0.042）3）4）1.02±0.042）Bcl-2/Bax 0.23±0.02 0.03±0.011）0.05±0.02 0.09±0.022）3）0.16±0.052）3）4）0.15±0.032）

3.2 嚴(yán)氏強(qiáng)心飲改善HF大鼠心臟功能可能與PI3K/Akt/Caspase-9信號(hào)通路調(diào)節(jié)有關(guān)

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，隨著嚴(yán)氏強(qiáng)心飲給藥濃度升高PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bcl-2/Bax比值均逐漸升高，而Caspase-9、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)均逐漸降低。這提示嚴(yán)氏強(qiáng)心飲改善HF大鼠心臟功能可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/Caspase-9信號(hào)通路有關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，可以通過(guò)直接或間接的形式抑制細(xì)胞凋亡，從而減緩心力衰竭的發(fā)展進(jìn)程［15］。Caspase家族分為包括Caspase-9在內(nèi)的凋亡啟動(dòng)因子和包括Caspase-3在內(nèi)的凋亡執(zhí)行因子兩類［16］，兩者都是Akt下游的靶蛋白，是各類細(xì)胞凋亡的最好途徑，其能夠破壞細(xì)胞骨架，裂解DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。因此，對(duì)Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，是有效抑制心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。嚴(yán)氏強(qiáng)心飲可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，使Akt活化后，降低Caspase-9表達(dá)，抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使下游的Caspase-3不被激活，實(shí)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行程序，抑制細(xì)胞凋亡，從而減緩心力衰竭的發(fā)展進(jìn)程?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax之間的平衡是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵［18］，嚴(yán)氏強(qiáng)心飲可以激活PI3K，促使其下游的Akt發(fā)生磷酸化而被激活參與信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)Bcl-2的釋放并抑制Bax的表達(dá)，增加HF大鼠心肌細(xì)胞抗凋亡能力，減少心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)量。

4 小 結(jié)

嚴(yán)氏強(qiáng)心飲能夠有效降低HF大鼠血清BNP水平，減少心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量，改善HF大鼠心臟功能，并能上調(diào)PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Caspase-9、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，提示其保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/Caspase-9信號(hào)通路有關(guān)。