豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的研究

王艷萍 曾維斌 楊順邦 賀昌萍

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

隨著胚胎工程技術(shù)的研究與應(yīng)用，卵母細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其需求量也越來越大，因此，建立并完善卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)(IVM，in vitro maturation)體系可為研究胚胎發(fā)育生物學(xué)、iPS、人類器官移植以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、核移植等技術(shù)的研究提供材料保障。卵母細(xì)胞成熟是指卵母細(xì)胞恢復(fù)和完成第一次減數(shù)分裂，進(jìn)入并停滯于第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)，此間伴隨核成熟和胞漿成熟兩個(gè)方面，核成熟是核膜破裂，同源染色體分離和排出第一極體，胞漿成熟是胞漿內(nèi)各種蛋白組成達(dá)到一定水平及線粒體的有效重排［1］。在體內(nèi)卵母細(xì)胞是在卵泡內(nèi)發(fā)育成熟的，卵泡大小對(duì)卵母細(xì)胞的成熟及受精后發(fā)育潛力起著至關(guān)重要的作用，促卵泡素(FSH)與促黃體素(LH)是參與卵母細(xì)胞成熟的最重要的蛋白質(zhì)激素，可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、膨散，LH 與受體結(jié)合，可促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，大大提高體外培養(yǎng)成熟率［2］。因此，本實(shí)驗(yàn)利用屠宰場(chǎng)廢棄的豬卵巢采集的卵母細(xì)胞，研究卵泡液、激素和卵泡大小對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)的影響，為進(jìn)一步的科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 成熟培養(yǎng)液的基礎(chǔ)液配制

以TCM199+10% FCS 為基礎(chǔ)，添加3.05 mMol/L葡萄糖、0.91mMol/L丙酮 酸 鈉、0.57 mMol/L L－ 半胱氨酸、75μg/ml 青霉素、50 ug/mL鏈霉素，定容、過濾、分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

FSH (促卵泡素)、LH (促黃體素)、PMSG (孕馬血清促性腺激素)是寧波激素制品廠生產(chǎn)，其它試劑如未特別注明，均購自Sigma 公司。

1.2 豬卵泡液的制備

用10 mL 注射器帶12 號(hào)針頭，從卵巢表面直徑4～7 mm的卵泡中抽取豬卵泡液。抽取的卵泡液放入1.5 mL 離心管中，2 000 rpm 離心20 min，取上清液于0.22 um的濾器過濾后，分裝并儲(chǔ)存于－20℃冰箱中備用。

1.3 卵母細(xì)胞的獲得

從屠宰場(chǎng)采集新鮮豬卵巢，保存在加青、鏈霉素的不低于30℃的生理鹽水中，2h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。卵巢經(jīng)無菌的生理鹽水中洗3 遍，用帶12 號(hào)針頭的注射器(10 mL)抽取卵巢表面的卵泡液，靜置、棄上清液后在體視顯微鏡下?lián)炻选Ｖ晃、B 級(jí)的COCs(卵丘－卵母細(xì)胞)，再經(jīng)mTCM199 液洗3 次后，放置在成熟培養(yǎng)液液滴中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)分組

實(shí)驗(yàn)1 以TCM199 +10% FCS(胎牛血清)為主的基礎(chǔ)液為對(duì)照組。再添加不同濃度5%、10%、20%的豬卵泡液。

實(shí)驗(yàn)2 以TCM199 +10% FCS+10% PFF(豬卵泡液)做對(duì)照組。再添加50 ug/ml FSH、LH、PMSG。

實(shí)驗(yàn)3 根據(jù)實(shí)驗(yàn)2 確定的最優(yōu)成熟培養(yǎng)液后，根據(jù)卵泡直徑的大小將其劃分為≤3 mm、4～7 mm和≥8 mm 三個(gè)等級(jí)，然后分別用吸取卵泡中的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 卵母細(xì)胞的體外成熟

將含有不同培養(yǎng)液的COCs的液滴培養(yǎng)皿放在5%CO2的空氣、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。44 h 后將COCs 置于實(shí)體顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞是否有第一極體的排出，以此作為判斷成熟的標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 單因素方差分析，試驗(yàn)重復(fù)數(shù)為6 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同水平的豬卵泡液對(duì)COCs 成熟的影響

從表1 可以看出，添加10%豬卵泡液的試驗(yàn)C組，其卵母細(xì)胞的成熟率要顯著(P＜0.05)高于分別添加對(duì)照組、5%與20% PFF的試驗(yàn)組，B、D 組之間差異不顯著，但其成熟率也要高于(P＜0.05)對(duì)照組。故實(shí)驗(yàn)2 將以C 組液為對(duì)照組。

表1 豬卵泡液不同添加水平對(duì)COCs 成熟的影響

2.2 添加不同種類的激素對(duì)COCs 成熟的影響

由表2 可以看出，B 組添加50 ug/ml FSH的卵母細(xì)胞成熟率最高，顯著高于(P＜0.05)其它三組。添加50 ug/ml LH的C 組和添加50 ug/ml PMSG的D 組之間差異不顯著，但均顯著高于(P＜0.05)對(duì)照組。

表2 添加不同種類的激素對(duì)COCs 成熟的影響

2.3 不同直徑卵泡對(duì)COCs 成熟的影響

由表3 可以看出，來自于直徑4～7 mm 大小卵泡的卵母細(xì)胞，在相同培養(yǎng)條件下其成熟率顯著高于(P＜0.05)≤3 mm 和≥8 mm的實(shí)驗(yàn)組。卵泡直徑≥8 mm 實(shí)驗(yàn)組顯著高于(P＜0.05)≤3 mm的實(shí)驗(yàn)組。

表3 不同直徑卵泡對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

3 討論

哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞在體外成熟中，卵泡液是重要的影響因素之一。豬卵泡液是卵泡中血清滲出物經(jīng)過新陳代謝活動(dòng)改變過的產(chǎn)物，包含有特殊成分，如卵泡壁細(xì)胞合成的類固醇和糖蛋白，卵泡液對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。劉曉輝等人［3］在TCM199 與NCSU－23 為主的培養(yǎng)液中添加豬卵泡液的對(duì)比試驗(yàn)中，添加組都比對(duì)照組顯著提高了卵母細(xì)胞的培養(yǎng)成熟率。而本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同添加水平的豬卵泡液培養(yǎng)卵母細(xì)胞，證明添加濃度為10%的豬卵泡液能更好地促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的成熟。

在卵母細(xì)胞體外成熟過程中，激素是促進(jìn)胞質(zhì)成熟的重要成分。秦鵬春［4］等認(rèn)為，F(xiàn)SH 和LH 對(duì)豬卵母細(xì)胞IVM 和排卵起到主要作用，Shimada［5］等認(rèn)為前20 h 添加FSH+LH，而后20 h 不添加FSH+LH，IVM 效果更好。馬紅［6］在研究促卵泡素對(duì)奶牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，一旦在成熟培養(yǎng)液中添加FSH，卵母細(xì)胞的成熟率也立刻上升，而通過不同濃度的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，隨著FSH 濃度上升，卵母細(xì)胞成熟率也隨之上升，F(xiàn)SH 濃度最終決定了成熟卵母細(xì)胞的數(shù)目，當(dāng)濃度達(dá)到50 ug/ml 時(shí)在促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟方面具有最佳作用。故本試驗(yàn)采用了這一劑量來研究單獨(dú)使用不同激素添加物對(duì)IVM的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSH 對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的效果更優(yōu)。

卵泡作為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟的環(huán)境，其對(duì)卵母細(xì)胞的成熟起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。卵泡直徑為0.5～1.6 mm 小卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞正進(jìn)行RNA的合成，而大卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞已貯存了足夠的RNA 以分成蛋白質(zhì)，故大卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的體外成熟率高。Yoon 等［7］研究發(fā)現(xiàn)3－8 mm 直徑卵泡的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于小于3 mm 卵泡的卵母細(xì)胞。豬卵泡直徑過大或過小，卵母細(xì)胞成熟能力均降低。大卵泡內(nèi)的細(xì)胞已成熟或過成熟，小卵泡內(nèi)細(xì)胞卻未發(fā)育成熟，只有3～5 mm 組卵泡的卵母細(xì)胞是生長(zhǎng)旺盛期適宜IVM［8］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，來自于直徑4～7 mm 大小卵泡的卵母細(xì)胞，在相同培養(yǎng)條件下其成熟率顯著高于(P＜0.05)≤3 mm 和≥8 mm的實(shí)驗(yàn)組。該結(jié)果與華冉東等人［9］的試驗(yàn)認(rèn)為來自豬卵泡3～6 mm的卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟率最好的結(jié)果相似。

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