微小RNA-21對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 凋亡的影響

許耀文 孫國通 劉雙梅

作者單位：266011 山東青島，青島市市立醫(yī)院本部心內(nèi)一科（許耀文）

262700 山東壽光，壽光市中醫(yī)醫(yī)院心血管病科（孫國通）

266071 山東青島，青島市市立醫(yī)院東院區(qū)干部保健科（劉雙梅）

微小RNA（microRNA，miR）是一類長度為18～ 25個(gè)堿基的小分子單鏈非編碼RNA，在生物體內(nèi)高度保守，具有基因調(diào)節(jié)作用，可通過特異性識別靶mRNA的3'非 編 碼 區(qū)（3'-untranslation region，3'-UTR）抑制靶mRNA的蛋白表達(dá)或直接降解靶mRNA，調(diào)節(jié)機(jī)體蛋白質(zhì)水平，人類約30%的基因受到miR的調(diào)節(jié)［1］。有研究表明，miR-21在心血管系統(tǒng)中存在高表達(dá)，可參與調(diào)節(jié)血管平滑肌、心肌細(xì)胞等的增殖、分化和凋亡［2］。心肌缺氧缺血導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是心臟缺血性疾病的本質(zhì)，因此減少心肌細(xì)胞的凋亡與壞死，增加細(xì)胞存活數(shù)量，是降低冠心病病死率的根本。其中心肌梗死（actue myocardial infarction，AMI）對心肌細(xì)胞的損傷最嚴(yán)重，其病死率逐年上升，患者預(yù)后較差［3］。因此在心肌缺血后及早通暢血流，對心肌組織的恢復(fù)有關(guān)鍵作用。近年來，缺氧缺血性疾病的發(fā)病機(jī)制需要進(jìn)一步探討，miR-21是否參與調(diào)控缺氧過程尚未清楚，明確其發(fā)病機(jī)制后，才能進(jìn)一步減少由缺血損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡。本研究在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）缺氧后，以及轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后觀察細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步探討miR-21在缺氧細(xì)胞凋亡中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 HUVEC購自江蘇省江陰齊氏生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，引物設(shè)計(jì)合成于廣州復(fù)能基因有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司，青霉素和鏈霉素雙抗購自默克Sigma公司。MGC AnaeroPack系列缺氧試劑盒及指示劑均購自日本三菱瓦斯化學(xué)系式會(huì)社，miR-21抑制劑和陰性對照品均購自上海吉瑪公司，流式細(xì)胞術(shù)凋亡試劑盒購于上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS和雙抗）培養(yǎng)原代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合80%～90%時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代培養(yǎng)，隔日換液。傳代細(xì)胞數(shù)量足夠多且培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%～90%時(shí)，將細(xì)胞按相同濃度接種到6孔培養(yǎng)板上，每瓶細(xì)胞數(shù)量約5×105個(gè)/孔。正常環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞1 d，至細(xì)胞穩(wěn)定并貼壁后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 缺氧處理 使用厭氧盒及厭氧產(chǎn)氣袋進(jìn)行缺氧處理。模型建立前先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后換液，立刻放入缺氧盒內(nèi)，缺氧盒內(nèi)加入一次性缺氧料和缺氧指示條（缺氧料可吸收O2，產(chǎn)生CO2），并立即密閉盒蓋，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行缺氧培養(yǎng)。厭氧指示條為粉色時(shí)提示盒中為無氧狀態(tài)，此刻開始計(jì)時(shí)。分別給予細(xì)胞不同時(shí)間的缺氧刺激，到時(shí)間后取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 研究分組 將培養(yǎng)的HUVEC分為6組，分別為正常對照組、缺氧6 h、12 h、24 h組、轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑+缺氧24 h組、陰性轉(zhuǎn)染+缺氧24 h組，每組3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測。本研究方案通過青島市市立醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號：2021-032）。

1.5 檢測各組細(xì)胞miR-21表達(dá) 收集各組細(xì)胞，采用離心柱法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后保存于-20 ℃冰箱，檢測miR-21水平，以內(nèi)參基因U6作為標(biāo)準(zhǔn)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用Δ循環(huán)閾值法，計(jì)算相對表達(dá)量即2-ΔΔCt。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，重新懸浮于結(jié)合緩沖液，加入熒光標(biāo)記的Annexin V和PI試劑，避光孵育15 min，30 min內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件錄入和分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常HUVEC和缺氧HUVEC的形態(tài)學(xué)觀察 正常HUVEC可見細(xì)胞貼壁生長，為扁平多角形，邊界清楚，細(xì)胞質(zhì)豐富；細(xì)胞核為圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮。缺氧狀態(tài)下HUVEC呈長梭形改變，并出現(xiàn)水腫及破裂。見圖1。

圖1 正常HUVEC（1A）和缺氧HUVEC（2B）的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2 細(xì)胞miR-21表達(dá)分析 以正常對照組miR-21 表達(dá)量為1，缺氧處理6 h、12 h、24 h組細(xì)胞的相對表達(dá)量均明顯低于正常對照組（均P＜0.05）。見圖2。

圖2 正常對照組與缺氧不同時(shí)間組的miR-21相對表達(dá)量

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 缺氧6 h、12 h、24 h 組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于正常對照組（均P＜0.05）。轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑+缺氧 24 h組的細(xì)胞凋亡率最高，為（16.1±1.34）%，明顯高于缺氧24 h組（P＜0.05）；陰 性轉(zhuǎn)染+缺氧24 h組的細(xì)胞凋亡率與缺氧24 h組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖3～4。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率

3 討論

圖4 各組細(xì)胞凋亡率比較

miR是一類具有調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在人類30%～40%的蛋白表達(dá)過程中都參與調(diào)節(jié)［2］。其中，miR-21在心血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，尤其在缺血性疾病（如冠心病、缺血性腎病、肺動(dòng)脈高壓等）患者體內(nèi)的表達(dá)水平有明顯變化［4］。然而，關(guān)于miR-21在HUVEC缺氧損傷過程中的表達(dá)變化尚未有報(bào)道。

近年來研究表明，miR-21是一種具有抗凋亡作用的RNA。在多種腫瘤細(xì)胞中，miR-21都發(fā)揮了明顯的抗凋亡作用。Kulshreshtha等［5］研究表明，miR-21表達(dá)在部分乳腺癌患者中上調(diào)。趙守香等［6］也發(fā)現(xiàn)miR-21通過負(fù)性調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞中STAT3基因的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞侵襲。Mace等［7］研究表明，胰腺癌患者癌細(xì)胞內(nèi)缺氧可介導(dǎo)miR-21的表達(dá)，通過缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞避免了由于缺氧環(huán)境導(dǎo)致的凋亡。Cheng等［8］在缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-21的表達(dá)降低可增加心肌細(xì)胞的凋亡。Yin等［9］向大鼠體內(nèi)注入化學(xué)合成的miR-21 類似物，結(jié)果顯示大鼠的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。然而，如果注入miR-21抑制物，則miR-21介導(dǎo)的保護(hù)作用消失。在大鼠心肌缺血后，隨著再灌注時(shí)間延長，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，因此過表達(dá)miR-21可減少細(xì)胞凋亡數(shù)量，提示miR-21可抑制細(xì)胞凋亡［10］。

本研究對體外培養(yǎng)的HUVEC以及轉(zhuǎn)染miR-21 抑制劑的HUVEC分別給予缺氧6 h、12 h、24 h的刺激，記錄各組miR-21表達(dá)水平的變化，并用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。本研究結(jié)果顯示，缺氧6 h、12 h、24 h的HUVEC中miR-21表達(dá)均下調(diào)，表明miR-21參與缺氧過程中內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過程。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示，隨著缺氧時(shí)間延長，細(xì)胞凋亡率明顯升高。轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑的細(xì)胞凋亡率明顯增高，與陰性轉(zhuǎn)染組比較有明顯差異，這都表明miR-21參與缺氧對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的過程，降低miR-21可能是缺氧促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，因此miR-21具有抗凋亡的作用。

miR-21在缺氧性心肌細(xì)胞損傷過程中可能通過抑制靶基因介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子〔程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）〕發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用［11］。PDCD4在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)后表達(dá)上調(diào)，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子［12］。Bcl-2是另一種與缺血性心臟疾病導(dǎo)致凋亡有關(guān)的基因，可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2/Bax決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡途徑，當(dāng)其比值降低時(shí)，細(xì)胞發(fā)生凋亡，caspase-3是此過程的執(zhí)行者［13-14］。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miR-21在HUVEC凋亡中發(fā)揮重要的抗凋亡作用，且對內(nèi)皮細(xì)胞具有調(diào)控作用，也為改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，控制動(dòng)脈硬化性疾病提供了新的治療方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突