MALDI-TOF MS技術在快速鑒定 革蘭陰性桿菌血流感染中的應用

呂婕 閆文萍 牛莉莉

作者單位：831100 新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州，昌吉回族自治州人民醫(yī)院

目前，臨床微生物實驗室大多具備開展血培養(yǎng)項目的資質，大部分微生物實驗室也配備了一到兩臺全自動血培養(yǎng)儀，如美國BD公司和法國生物梅里埃公司建立的全自動血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)。在系統(tǒng)運行過程中，當實驗室接收臨床送檢的血培養(yǎng)樣本后，實驗室工作人員只需將培養(yǎng)瓶直接放入血培養(yǎng)儀中，儀器即可對血培養(yǎng)瓶內的二氧化碳（carbon dioxide， CO2）或其他病原菌代謝產物的濃度變化進行實時監(jiān)測，當檢測濃度達到閾值后則會提示報警。工作人員取出報陽血培養(yǎng)瓶后，首先進行涂片的革蘭染色鏡檢，判斷染色性質和病原菌種類，為臨床提供血培養(yǎng)一級報告，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)報告的病原菌種類調整經(jīng)驗用藥。傳統(tǒng)的血培養(yǎng)從儀器報陽性到發(fā)出報告需要1～2 d的時間，經(jīng)轉種至瓊脂平板后，孵育過夜，在18～24 h時獲得足夠量對數(shù)生長期單個純菌落后，才能進行菌種的鑒定和藥敏試驗。許多研究人員通過各種方法盡可能縮短檢測時間，如采用分子生物學方法對陽性血培養(yǎng)瓶內致病菌直接進行基因檢測，但是該方法成本較高，因此未在臨床試驗中推廣。如何快速、有效地獲得病原菌種類，為臨床醫(yī)生提供用藥依據(jù)，縮短患者無效用藥療程，降低醫(yī)院內抗菌藥物的耐藥率，成為臨床微生物研究中亟待解決的問題。

血流感染是臨床常見的嚴重感染性疾病，具有發(fā)病急、病死率高的特點［1］。當患者發(fā)生疑似血流感染時，盡快明確致病微生物，根據(jù)藥敏特點給予快速有效的經(jīng)驗性抗菌藥物治療，對于感染進程的控制、降低患者經(jīng)濟負擔和挽救患者生命都是至關重要的，不僅可以顯著提高患者存活率，還可以大大降低醫(yī)療費用［2］。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年發(fā)展起來的一種新型生物軟電離質譜，能簡單和高效地測得細菌肽質量指紋譜（peptide mass fingerprinting，PMF），以數(shù)據(jù)庫查詢識別的方式對蛋白質組學進行鑒定，可以大大縮短病原菌鑒定時間，為臨床提供快速、準確的治療依據(jù)。當前，國內外學者均曾嘗試使用梅里埃VITEK MS質譜儀的MALDI-TOF MS技術直接檢測血培養(yǎng)陽性瓶中的致病微生物，如采用細胞裂解法和分離膠促凝管輔助法等［3-4］。本研究擬采用MALDI-TOF MS技術結合分離膠促凝管短時培養(yǎng)法，在規(guī)定時間（1 h、2 h、 4 h、6 h）內直接鑒定陽性血培養(yǎng)瓶中的革蘭陰性（Gram negative，G-）桿菌，同時進行傳統(tǒng)轉種培養(yǎng)。采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀進行細菌鑒定，并以其結果作為標準，將分離膠促凝管短時培養(yǎng)法結果與常規(guī)方法進行比較，確定該方法的可行性與準確性。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2020年1月—2021年12月昌吉回族自治州人民醫(yī)院微生物室BacT/ALERT 3D 全自動血培養(yǎng)儀檢測的報陽血培養(yǎng)瓶，經(jīng)涂片染色確認為單一G-桿菌病原菌感染的163份標本，同時采用分離膠促凝管短時培養(yǎng)法和傳統(tǒng)常規(guī)轉種培養(yǎng)法進行病原體培養(yǎng)。分離膠促凝管短時培養(yǎng)法在規(guī)定時間（1 h、2 h、4 h、6 h）內使用梅里埃VITEK MS質譜儀直接鑒定。傳統(tǒng)常規(guī)轉種培養(yǎng)法經(jīng)過隔夜孵育后，使用梅里埃VITEK2 Compact全自動細菌鑒定儀進行鑒定。將陽性血培養(yǎng)液直接涂片革蘭染色后證實為單一G-菌感染，排除其他致病菌，如酵母樣真菌、革蘭陽性（Gram positive，G+）球菌等。同一患者送檢的需氧瓶和厭氧瓶或兒童瓶都納入其中。

1.2 儀器與試劑 HF151UV CO2培養(yǎng)箱購自濟南泰醫(yī)生物技術有限公司，VITEK MS質譜儀、BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀、VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀均購自法國梅里埃診斷產品上海有限公司，TGL-16M高速離心機由長沙湘儀離心機儀器有限公司提供。VITEK MS-DS靶板、VITEK MS-CHCA基 質液、血培養(yǎng)瓶、G-鑒定卡GN均購自法國梅里埃診斷產品上海有限公司，血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板均購自鄭州安圖生物工程有限公司，分離膠采血管由美國BD上海有限公司提供，1 μL一次性接種環(huán)購自江蘇康健醫(yī)療用品有限公司。試劑均在有效期內使用。

1.3 研究方法

1.3.1 血培養(yǎng)及染色鏡檢 收集不同種類臨床血培養(yǎng)樣本，包括標準需氧瓶、厭氧瓶、兒童瓶，放入BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)進行孵育，當5 d內出現(xiàn)陽性報警時，立即取出陽性需氧或厭氧培養(yǎng)瓶，從血培養(yǎng)瓶中以無菌操作抽取培養(yǎng)液，直接進行涂片和革蘭染色鏡檢，確定為單一G-桿菌生長的陽性標本，排除假陽性或混合菌感染。

1.3.2 分離膠促凝管短時培養(yǎng)法 在生物安全柜中將陽性血培養(yǎng)瓶瓶口采用75%乙醇消毒后，顛倒混勻數(shù)次，使用一次性注射器抽取3 mL培養(yǎng)液注入含分離膠的黃頭真空采血管內，以3000 r/min離心 10 min，用移液器小心棄去上清液，用1 μL一次性接種環(huán)輕輕刮取分離膠表層菌膜，在血瓊脂平板上密涂2 cm×2 cm大小轉種區(qū)，放入35 ℃、5% CO2恒溫孵育箱內進行培養(yǎng)。

1.3.3 MALDI-TOF MS快速鑒定法 轉種培養(yǎng)1 h、 2 h、4 h、6 h后，分別觀察濃集菌生長情況，使用VITEK MS質譜儀直接進行鑒定分析。使用1 μL一次性接種環(huán)挑取標準菌株，將大腸埃希菌ATCC8739涂于中心校準位點，并將待測菌涂布于靶板上，待菌膜未完全干燥時加入1 μL CHCA基質液，室溫下自然干燥后進行VITEK MS質譜分析。

1.3.4 傳統(tǒng)轉種培養(yǎng)法 將報陽血培養(yǎng)瓶在生物安全柜中以無菌操作抽取適量培養(yǎng)液，涂于血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板上，分區(qū)劃線，在35 ℃、5% CO2恒溫箱內孵育過夜。18～24 h后獲得足夠的單個菌落，觀察菌落形態(tài)，挑取純菌落，配制0.5 麥氏濁度菌懸液，插入G-鑒定GN卡，使用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀進行細菌鑒定，結果所得致病微生物為標準鑒定結果。

1.4 質量控制（質控） 革蘭染色質控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922 和金黃色葡萄球菌 ATCC25923，MALDI-TOF MS校準菌株為大腸埃希菌 ATCC8739，上述菌株均由美國菌種保藏中心提供。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，以傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結果為對照，比較分離膠促凝管短時培養(yǎng)法質譜鑒定結果的準確性，將置信度＞85%的數(shù)據(jù)作為鑒定結果，將比對準確的數(shù)據(jù)納入數(shù)據(jù)分析，其余均視為鑒定無結果，將鑒定無結果、頻譜采集錯誤、波峰不足、鑒定出≥2種菌種且置信度 低［5］的鑒定結果予以剔除。

2 結果

2.1 革蘭染色與傳統(tǒng)鑒定法結果比較 實驗期間經(jīng)革蘭染色排除G+菌、真菌感染和混合菌感染后，共有163份G-血培養(yǎng)陽性瓶用于實驗，經(jīng)過18～ 24 h轉種培養(yǎng)后，采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀可鑒定出所有細菌。

2.2 MALDI-TOF MS快速鑒定法鑒定結果 分離膠促凝管離心后短時培養(yǎng)1 h、2 h、4 h、6 h后，分別對G-菌采用VITEK MS質譜儀直接進行鑒定，除4份標本未出結果外，鑒定成功率分別為78.6%、85.5%、96.2%、100.0%。見表1。

表1 不同培養(yǎng)時間的G-菌鑒定成功率

2.3 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀與MALDI- TOF MS結果比較 將傳統(tǒng)培養(yǎng)法VITEK2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定結果與MALDI-TOF MS快速鑒定法在1 h、2 h、4 h、6 h時間段內可鑒定到屬種的菌株數(shù)進行比較，結果見表2。

表2 G-菌在不同時間段的鑒定結果

3 討論

據(jù)國內文獻報道，每年世界范圍內患者病死率統(tǒng)計中，血流感染引起的死亡患者數(shù)都在較高水平，住院患者院內膿毒癥發(fā)病率為48.56/10萬［6］，總病死率約為30%～40%［7］。對于膿毒性休克伴低血壓的患者來說，每延遲1h采取有效抗菌治療就會導致患者的平均存活率降低7.6%［8］。因此，快速準確的血培養(yǎng)結果可以更好地幫助和指導臨床科學合理用藥，及時治愈患者［9］。對引起血流感染的病原微生物進行快速、準確的鑒定對保障患者的生命安全至關重要。

傳統(tǒng)的血培養(yǎng)從報陽到發(fā)出鑒定到屬或種的最終報告，需要1～2 d的時間，耗時較長，不僅無法滿足臨床需要，還會造成醫(yī)患矛盾的產生。一些核酸檢測技術〔如熒光實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）等〕雖然可以快速鑒定出導致患者血流感染的病原菌，但是檢測的成本高，耗時較長，操作流程復雜，鑒定菌種種類受限于引物，并且需要專業(yè)技術人員進行操作，因此臨床應用率較低。還有學者采用多次洗滌、離心的方法獲得病原菌，進行生化反應鑒定，可以使報告周期有所縮短，但時效上仍然不及VITEK MS質譜儀MALDI-TOF MS技術的應用。

MALDI-TOF MS技術將瓊脂平板上生長的單個菌落點涂于靶板上，與基質溶液充分作用后，在質譜儀內接受多次激光照射，在電荷解離過程中，基質吸收激光并與菌體一起解吸。電場引導離子進入真空管，根據(jù)質量及飛行時間分離離子，較小的分子飛行速度較快，并以一系列線或峰顯示結果。通過分析質譜片段推導出分子結構，與大量細菌種屬生成的質譜數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得達到可信水平的微生物鑒定結果。既往研究中，將MALDI-TOF MS技術應用于單一病原菌血流感染時，菌株鑒定的準確率可達到66%～97%，但處理陽性血培養(yǎng)液往往需要繁瑣的人工操作以獲得足量、純化的病原菌蛋白，方能進行質譜分析［2］。本研究中，我們采用真空分離膠采血管一步離心法將病原菌與血漿和血細胞分離，用時僅10 min，收集病原菌后短時培養(yǎng)，利用MALDI-TOF MS技術進行特征性蛋白波峰分析，對臨床血流感染常見的細菌均獲得了比較滿意的鑒定結果。該方法僅需額外使用真空分離膠采血管和離心機，步驟簡單，操作簡便，使用儀器也都是實驗室的常備儀器，適用于實驗室日常工作。

MALDI-TOF MS技術既可以對臨床標本分離出的純菌落進行鑒定，也可以對臨床上未經(jīng)分離培養(yǎng)的標本進行直接鑒定，與常規(guī)生化反應鑒定方法比較，可以大大縮短細菌鑒定時間，使時效性明顯改善，極大地緩解了臨床壓力，為臨床爭取寶貴的治療時間，在試劑成本上也更為低廉，更具有臨床推廣價值。本實驗通過含分離膠的采血管離心處理陽性標本，能將碳粉及大部分紅細胞分離至分離膠下層，使細菌聚集在上層血清與分離膠的交界處，為細菌的快速提取提供了有利條件。有學者在既往關于血培養(yǎng)陽性菌直接鑒定的研究中發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS 技術對G-菌的鑒定成功率較高，這也是用較少時間就能獲得較高鑒定符合率的原因之一。本研究159份 G-菌中，有85.5%的菌株在培養(yǎng)2h時就能被成功鑒定，高于已有的一些同類研究中G-菌血流感染鑒定成功所占的比例［10］。

與使用傳統(tǒng)方法鑒定出致病菌比較，本實驗VITEK MS鑒定中有2%（4/163）的鑒定無結果的原因可能是由于血培養(yǎng)標本中菌種濃度較低，或碳粒、血細胞碎片等有形成分的存在，也可能是在離心過程中蛋白質丟失，導致細菌鑒定的效果不佳。

本實驗結果表明，采用MALDI-TOF MS技術對分離膠促凝管短時培養(yǎng)法在瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)過短時培養(yǎng)的血培養(yǎng)陽性標本進行快速病原菌鑒定是一個早期可靠的方法，并且不需要額外的標本預處理試劑及裂解、洗滌等日常鑒定流程以外的步驟。本方法的另外一個缺點就是由于質譜本身的局限性，對于多重菌株感染的血培養(yǎng)標本不能進行鑒定，因此標本的來源極為有限，且因地區(qū)有所差異，也不適用于其他地區(qū)。

綜上所述，本研究利用梅里埃VITEK MS質譜儀MALDI-TOF MS技術，與分離膠促凝管短時培養(yǎng)法在規(guī)定時間（1 h、2 h、4 h、6 h）內直接涂布于靶板進行快速鑒定，對G-桿菌所致的血流感染陽性血培養(yǎng)標本具有較高的菌種鑒定準確率，可以大大縮短病原菌鑒定時間，有助于臨床及時獲取病原菌種類。血培養(yǎng)作為診斷血流感染的“金標準”［11］，也可以為臨床精準治療提供依據(jù)。本研究只是對該方法的實驗室可行性進行評估，但此方法會對臨床用藥帶來哪些影響和改變尚未可知。MALDI-TOF MS技術對給予患者有效抗菌藥物治療、改善患者預后、降低醫(yī)療成本具有至關重要的臨床應用價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突