微波消解?電感耦合等離子體質(zhì)譜快速測定葡萄籽提取物微量元素的研究

方 嵐 潘小紅

（1.云南省食品藥品審核查驗中心，云南 昆明 650106；2.湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南 長沙 410001）

葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）是葡萄籽提取分離得到的原花青素等多酚類物質(zhì)[1]，其生物活性的研究在國內(nèi)外已非常廣泛。研究表明，其具有清除自由基[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗菌[5]、抗疲勞[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、保護(hù)機(jī)體損傷[9]等藥理作用，對阿爾茨海默病具有一定的防治作用[10]，廣泛用于藥品、食品及化妝品行業(yè)。葡萄籽花青素研究有大量文獻(xiàn)報道[11?13]，但微量元素的分析鮮有研究。有研究表明，微量元素參與細(xì)胞代謝，與蛋白質(zhì)結(jié)合形成酶、激素；微量元素與一些功效成分有關(guān)，決定了食品、藥品、化妝品的安全性，在植物體本身所含微量元素之間的協(xié)同和拮抗有關(guān)[14?18]。

電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP?MS）作為近年元素分析的熱點(diǎn)方法，具有線性范圍寬、精密度高、檢測速度快、可進(jìn)行實(shí)時檢測等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于中藥、食品、化妝品等的痕量和超痕量分析。至今為止，尚未見采用ICP?MS 測定葡萄籽提取物中微量元素含量的相關(guān)報道。本研究采用高壓微波消解，建立葡萄籽提取物微量元素ICP?MS 檢測方法，并對葡萄籽中47 種微量元素進(jìn)行測定，應(yīng)用芹菜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對該方法進(jìn)行驗證表明，此方法提高了葡萄籽微量元素測定的靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度。研究結(jié)果以期為葡萄籽提取物微量元素含量測定提供參考依據(jù)，同時為葡萄籽提取物的質(zhì)量監(jiān)管提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗樣品

葡萄（Vitis vinifera）種子樣品共11 批，分別為湖南省保健食品加工廠種子（S1）、湖南省保健食品加工廠種子（S2）、匯生源生物科技種子（S3）、奧邦生物科技種子（S4）、鼎盛生物食品種子（S5）、貴研坊生物種子（S6）、石家莊健禾生物科技有限公司種子（S7），原料產(chǎn)地新疆；龍騰生物種子（S8），原料產(chǎn)地山西；浙江一諾生物科技種子（S9），原料產(chǎn)地山東；天津市尖峰生物科技種子（S10）、圣嘉德生物老店種子（S11），原料產(chǎn)地法國。

1.1.2 儀器設(shè)備

儀器設(shè)備：電感耦合等離子體質(zhì)譜儀7700 Series（美國Agilent 公司），微波消解儀Mars5（美國CEM 公司），電子控溫加熱板BHW?09C（中國博通公司），A10 超純水機(jī)Milli?Q（美國Millipore），電子天平XS204（瑞士Mettle Toledo）。

1.1.3 試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液

1）試劑：硝酸，購自德國Merck 公司，為優(yōu)級純。質(zhì)譜調(diào)諧液，購自美國Agilent 公司，密度為 1 μg/L，元素種類為Ce、Co、Li、Mg、Y、Ti。

2）標(biāo)準(zhǔn)溶液：銀、砷、鋇、鈹、鉍、鎘、鈷、鉻、銫、鋰、銅、銦、鋰、錳、鎳、鉛、銣、鈧、鍶、鈦、釩、鑭、鈰、鐠、銣、釤、銪、釓、鋱、鈥、鉺、銩、鐿、镥、釔標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 μg/L，來自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；鉀、鈣、鎂、鈉、硼、鋁、鐵、鋅、錫、銫、鉬、銻、汞、銠、錸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均為1 000 μg/mL，來自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 儀器工作條件

為確保盾構(gòu)管片受力對稱，避免隧道軸線偏移，則需要在同環(huán)布置兩個注漿孔，且兩孔均勻?qū)ΨQ注漿；隧道縱向采取間隔跳孔施工的原則，間隔環(huán)數(shù)不宜少于2環(huán)管片[12]，且為避免加固段與非加固段在后期產(chǎn)生過大的差異沉降，建議設(shè)置一定范圍的過渡段。注漿孔位的布置詳見隧道下臥層注漿加固橫斷面(見圖5)和隧道下臥層注漿加固范圍(見圖6)。同時，每個注漿孔應(yīng)通過分層、少量、多次的方式從隧道底部向下分層搭接疊加注漿，使隧道沉降在注漿抬升和注漿間隔時間內(nèi)的固結(jié)沉降的交替作用下漸趨穩(wěn)定，直至兩次注漿間隔時間內(nèi)的沉降量趨于零時，則停止注漿。

用質(zhì)譜調(diào)諧液對ICP?MS 進(jìn)行調(diào)諧，優(yōu)化儀器工作參數(shù)，使儀器質(zhì)量軸、靈敏度、氧化物、雙電荷、分辨率等各項指標(biāo)達(dá)到最佳。射頻功率1 550 W，采樣深度8.0 mm，鎳（Ni）采樣錐，同心霧化器，冷卻氣流量15.0 L/min，載氣流速1.0 L/min，補(bǔ)償氣流量0.8 L/min，樣品提升速率1.0 mI/min，蠕動泵采集轉(zhuǎn)速0.1 r/min，蠕動泵30 s提升轉(zhuǎn)速0.3 r/min，穩(wěn)定40 s，樣品測定3 次，B、Al、Se 元素為No gas 模式，其余元素為He模式。

1.2.2 樣品溶液的制備

將葡萄籽破碎，以70%乙醇提取，濃縮，稀釋，沉淀，經(jīng)大孔吸附樹脂吸附、洗脫、干燥，得到葡萄籽提取物。每種樣品取0.50 g 于微波消解罐中，加入硝酸7 mL，輕輕搖動使樣品散開，旋緊蓋子，靜置過夜，放于微波消解儀內(nèi)。消解程序：室溫至130 ℃，升溫時間5 min，保持時間1 min；130～160 ℃，升溫時間3 min，保持時間5 min；160～180 ℃，升溫時間5 min，保持時間30 min，溫度120 ℃條件下趕酸至蒸氣揮盡，分次溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，定容至刻度。同法進(jìn)行試劑空白的操作。

1.2.3 同位素及內(nèi)標(biāo)溶液的選擇

在ICP?MS 分析中：一方面可以通過選擇合適的同位素來盡可能地避免同質(zhì)異位素和多原子離子的干擾；另一方面內(nèi)標(biāo)元素能有效地監(jiān)控和校正分析信號的短期和長期漂移，并對基體效應(yīng)具有明顯的補(bǔ)償作用[14?15]。本研究選用103Rh、185Re在線為內(nèi)標(biāo)，測量同位素，見表1。以內(nèi)標(biāo)元素克服基體效應(yīng)和校正分析信號的飄移[19]，用2% HNO3溶液逐級稀釋Rh、Re 至濃度為200 ng/mL 的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

表1 測量同位素Table 1 Isotopes for measurement

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度的選擇

本實(shí)驗取多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（35 種）[20]及單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液用2% HNO3溶液逐級稀釋成一定濃度的中間溶液，其中Ca、Mg、Na、K 為160 μg/mL，F(xiàn)e、Al 為40 μg/mL，Zn、Ti、B 為8 μg/mL，Hg 為0.016 μg/mL，其余元素為0.4 μg/mL。分別取上述中間溶液0.10、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 倒入50 mL 容量瓶中，用2% HNO3溶液稀釋至要求刻度。標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度：Ca、Mg、Na、K 為0.32、3.2、6.4、9.6、12.8、16.0 μg/mL，F(xiàn)e、Al 為0.08、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 μg/mL，Zn、Ti、B 為0.016、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 μg/mL，Hg 為0.032、0.32、0.64、0.96、1.28、1.60 ng/mL，其余元素為0.8、8、16、24、32、40 ng/mL。重復(fù)3 次。

1.3 測定及分析方法

取參試樣品按優(yōu)化的儀器參數(shù)及處理方式，編制測定方法，在線引入內(nèi)標(biāo)103Rh、185Re，并觀察其靈敏度，儀器穩(wěn)定后，依次引入配制好的試劑空白、標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品空白、樣品溶液。根據(jù)待測同位素，應(yīng)用校正方程計算葡萄籽提取物各元素的含量。選用芹菜（Apium graveolens）成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)元素的測定值與參考值進(jìn)行比較，并計算RSD 值，驗證該方法對葡萄籽微量元素測定的靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度的選擇

ICP?MS 的干擾分為質(zhì)譜干擾和非質(zhì)譜干擾（基體效應(yīng)），其中非質(zhì)譜干擾?基體效應(yīng)主要有空間電荷效應(yīng)、信號的抑制或增強(qiáng)效應(yīng)、由高含量總?cè)芙夤腆w引起的物理效應(yīng)。非質(zhì)譜干擾消除方法有稀釋樣品、內(nèi)標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、去除基體等，質(zhì)譜干擾主要有同量異位素重疊、多原子或加合物離子、難熔氧化物離子、雙電荷離子。解決辦法主要通過優(yōu)化儀器條件參數(shù)，選擇無干擾同位素（如78Se 代替80Se），應(yīng)用干擾校正方程，冷等離子體技術(shù)，碰撞/反應(yīng)池技術(shù)[21?23]。實(shí)驗結(jié)果表明：Ca、Mg、Na、K 在0～16.0 μg/mL，F(xiàn)e、Al 在0～4.0 μg/mL，Zn、Ti、B 在0～0.80 μg/mL，Hg 在0～1.60 ng/mL，其余元素在0～40 ng/mL范圍內(nèi)，方法的線性關(guān)系良好，47 種元素的相關(guān)系數(shù)為0.995 9～1.000 0，滿足檢測需求，結(jié)果見表3。

表3 元素標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 The standard curve of elements

續(xù)表 3

2.2 精密度、回收率及準(zhǔn)確性分析

葡萄籽提取物為植物性原料，為了驗證本實(shí)驗室建立的微波消解處理樣品及電感耦合等離子體質(zhì)譜的實(shí)驗方法與步驟是否符合要求，所得數(shù)據(jù)是否準(zhǔn)確可信。選用芹菜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)元素的測定值與參考值進(jìn)行比較，并計算RSD 值，47種元素的精密度數(shù)值均在 0.1%～5.4%，回收率為82.7%～112.8%，符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測定》（GB 5009.268—2016）[24]第一法ICP?MS 精密度的要求，見表4。

表4 精密度、空白回收率及準(zhǔn)確性Table 4 The precision,accuracy and the recovery rate

續(xù)表 4

2.3 檢出限的檢測

檢出限的高低能準(zhǔn)確地反應(yīng)儀器的性能。本研究用制備標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液，2% 硝酸為空白溶液，連續(xù)11 次測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3 倍為檢出限，大多數(shù)元素的檢出限小于0.1 μg/L，見表5。

表5 47 種元素的檢出限 Table 5 The LOD for 47 elements μg/L

2.4 葡萄籽提取物樣品的測定

11 批葡萄籽提取物47 種元素的測定結(jié)果見表6。從測定結(jié)果可以看出：葡萄籽提取物中的元素含量較豐富；不同葡萄籽提取物中相同元素測定結(jié)果相差較大，但仍呈現(xiàn)相同的規(guī)律。鉀、鎂、鈉、鈣、鐵元素含量高；鋁、錳、鎳、銅、硼、鋅、銣、鍶、錫、鋇、鉬元素相對較高；鉛、砷、汞、鎘、鉻及15 種稀土元素含量較低；鋰、鈹、銀元素極低，甚至未檢出。

表6 樣品測定結(jié)果Table 6 The determination results of samples

續(xù)表 6

3 結(jié)論與討論

運(yùn)用電感耦合等離子體質(zhì)譜法進(jìn)行微量元素測定時，植物樣品的分解和有機(jī)溶劑的殘留會影響測定結(jié)果。本研究采用微波消解進(jìn)行前處理，操作簡單，消解完全，處理耗時少，樣品不容易被污染，可以避免樣品分解和有機(jī)溶劑殘留對實(shí)驗的影響。因電感耦合等離子質(zhì)譜法具有線性范圍寬、準(zhǔn)確性較高、靈敏度較高、可同時進(jìn)行多元素快速分析的特點(diǎn)，目前已在中藥、食品、化妝品領(lǐng)域廣泛運(yùn)用[21?25]。

本研究采用微波消解?電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定葡萄籽提取物所含的鉀、鎂、鈉、鈣、鐵等 47 種元素的方法。通過對測定方法、同位素和內(nèi)標(biāo)溶液的選擇精密度、回收率及準(zhǔn)確度等實(shí)驗，建立了葡萄籽提取物中47 種微量元素ICP?MS 方法。采用硝酸溶液加入測試樣品進(jìn)行微波消解后,以103Rh、185Re 作為內(nèi)標(biāo),47 種元素的相關(guān)系數(shù)為0.995 9～1.000,方法檢出限為0.001 1～0.087 μg/L,加標(biāo)回收率為82.7%～112.8%。運(yùn)用本方法對葡萄籽提取物多種元素的含量同時進(jìn)行檢測,具有快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高、精密性好等優(yōu)勢。有文獻(xiàn)[26]報道采用ICP?AES 方法測定葡萄籽提取物中的18 種元素含量，檢出限為0.009～0.081；本研究選用ICP?MS 法測定元素，檢出限低，線性范圍寬，可以為葡萄籽提取物的質(zhì)量控制、安全性評價提供基礎(chǔ)研究。

從11 批葡萄籽提取物47 種元素的測定結(jié)果看，葡萄籽提取物的元素含量較豐富，不同葡萄籽提取物中相同元素測定結(jié)果相差較大，但仍呈現(xiàn)相同的規(guī)律。有益元素鉀、鎂、鈉、鈣、鐵元素含量高；有害元素鉛、砷、汞、鎘、鉻及15 種稀土元素含量較低；鋰、鈹、銀元素極低，甚至未檢出。但本實(shí)驗不足的是葡萄籽提取物樣品主要為網(wǎng)絡(luò)少量購買，產(chǎn)品基本為散裝，信息不全，缺少批號、提取工藝、提取原料、產(chǎn)品品種、部分廠家等信息，推測這也是不同葡萄籽提取物相同元素測定結(jié)果相差很遠(yuǎn)的一個原因。在今后的研究中，以期收集更多不同產(chǎn)地的葡萄籽提取物，測定與葡萄品種、屬地、提取工藝結(jié)合研究，積累更多數(shù)據(jù)。進(jìn)一步探討植物體內(nèi)金屬元素的含量差異是否與其被臨床研究證明的作用有關(guān)，是協(xié)同作用或是拮抗作用，還有待進(jìn)一步研究。植物體各種元素的主要來源是土壤，其含量與環(huán)境中的元素含量有一定的相關(guān)性[27]，可以通過對不同產(chǎn)地的地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品所具有的元素種類和含量進(jìn)行檢測分析，為產(chǎn)地溯源提供技術(shù)支撐。