BpmiR156 過表達白樺株系的獲得及扦插生根研究

李思雨 李玉杰 李新貌 彭 鑫 馬 慶 申婷婷 李慧玉

（東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

microRNA（miRNA）是一類長度約20～24 bp的小分子非編碼RNA，最早于1993 年在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[1]。2002年Reinhart 等在擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗和花中首次發(fā)現(xiàn)了16 個植物miRNA[2]，隨后，在植物中大量miRNA 家族陸續(xù)被挖掘，對于miRNA的功能研究也越來越深入。在植物中，這類RNA主要通過對其下游的靶基因剪切降解來參與調(diào)控植物根、莖、葉等營養(yǎng)器官及生殖器官的發(fā)育；并在低溫、干旱、鹽、重金屬等非生物脅迫及生物脅迫中發(fā)揮重要作用[3?8]。

miR156是具有高度保守性的miRNA，其在蕨類、苔蘚類植物、單子葉植物及雙子葉植物中均有分布[9]。miR156是目前唯一已知的能感知年齡的miRNA，作為年齡的一種響應(yīng)因子，隨著植物年齡的增長，其表達含量逐漸下降，在玉米（Zea mays）[10]、水稻（Oryza sativa）[11]中都有相同表達趨勢。同時miR156的含量也決定了植物的生理學年齡，在擬南芥中，過量表達miR156的植株表現(xiàn)為童期延長、開花延遲的特點[12]；在轉(zhuǎn)基因加拿大楊（Populus × canadensis）中，過表達miR156株系靶基因表達降低，幼年期顯著延長[13]。miR156通過調(diào)控其靶基因SPL家族轉(zhuǎn)錄因子以miR156/SPL模式參與調(diào)節(jié)植物的成花轉(zhuǎn)變、葉子發(fā)育、分枝、次生產(chǎn)物代謝過程、果實成熟及非生物脅迫應(yīng)答等過程[12,14]。

白樺（Betula platyphylla）是我國東北地區(qū)蓄積量最大的鄉(xiāng)土速生闊葉樹種，也是天然次生林更替的先鋒樹種。我國白樺良種選育工作始于“八五”期間，獲得了一批省級及國家級良種。很多科研團隊也開展了白樺扦插繁殖技術(shù)研究，但插穗生根難的問題仍未得到解決，制約了白樺良種化推廣進程。基于此，本研究利用Gateway 技術(shù)構(gòu)建了白樺miR156過表達載體，并成功獲得了轉(zhuǎn)miR156過表達白樺株系，通過研究轉(zhuǎn)基因株系扦插不定根生根率及不定根發(fā)生過程中的解剖結(jié)構(gòu)，探究miR156過量表達對白樺扦插生根的影響。本研究將為突破白樺扦插生根難的瓶頸提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 BpmiR156 基因克隆

根據(jù)白樺基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（https://genomevolution.org/CoGe/GenomeInfo.pl?gid=35080），設(shè)計克隆基因特異引物：miR156?F（5′?CACCGTTTCCACATCTGGGAATAAGC?3′）和miR156?R（5′?TCAGCAGCTGTTGAAGTTGAAGG?3′），以白樺的cDNA 作為模板，擴增包含BpmiR156成熟序列的254 bp 的片段，反應(yīng)體系為20 μL，包含：2 μL 10×KOD Buffer、2 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、1.2 μL MgSO4、0.3 μL KOD Plus Neo、0.6 μLmiR156?F （10 μmol/L）、0.6 μLmiR156?R（10 μmol/L）、2 μL 模板和11.3 μL 無菌水組成。反應(yīng)程序為94 ℃預變性2 min 后，進行PCR 循環(huán)：94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，35 個循環(huán)后繼續(xù)在72 ℃延伸7 min。

1.2 BpmiR156 植物過表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

純化后的PCR 產(chǎn)物通過TOPO 反應(yīng)連接到入門載體（pENTRTM/D?TOPO Cloning Kit,invitrogen）上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞（購于寶生物工程（大連）有限公司），挑取單克隆進行PCR 檢測（方法同1.1，用菌液做模板），將陽性克隆進行測序。提取上述TOPO 反應(yīng)后經(jīng)檢測的陽性單克隆的質(zhì)粒，進行LR 反應(yīng)，將TOPO重組質(zhì)粒連接至pGWB2 載體上。將重組質(zhì)粒pGWB2?BpmiR156通過電擊轉(zhuǎn)化法導入到EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，在固體LB（含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L 利福平）培養(yǎng)基上進行篩選，獲得帶有重組質(zhì)粒并具有卡那霉素抗性和利福平抗性的根瘤農(nóng)桿菌，作為侵染植物用的工程菌。通過農(nóng)桿菌介導的白樺合子胚轉(zhuǎn)化法進行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化[15]。

1.3 轉(zhuǎn)BpmiR156 白樺的PCR 檢測

通過改良的CTAB 法提取轉(zhuǎn)基因白樺總DNA，以提取的轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟逯晗档腄NA 為模板，以pGWB2?miR156為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因白樺（WT）為陰性對照，分別以基因序列設(shè)計上游引物（miR156?F：5′?CACCCATCTGGGAATAAGC?3'），以載體序列設(shè)計下游引物（pGWB2?R：5′?ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGG?3′）進行PCR 擴增反應(yīng)體系及程序同1.1，產(chǎn)物用1.0 %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.4 轉(zhuǎn)BpmiR156 白樺扦插生根及解剖鑒定

取轉(zhuǎn)BmiR156過表達白樺株系及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟瀹斈晟壑舫珊? 個芽點的插穗，在由多菌靈（50%）處理的基質(zhì)（V（黑土）∶V（草炭土）∶V（蛭石）=2∶2∶1）中扦插，附上保鮮膜，放置在植物培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：室溫25 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗。扦插30 d 統(tǒng)計轉(zhuǎn)miR156過表達白樺株系及對照白樺扦插生根率。并在扦插后0、3、6、9、12、15、18、21 d 分別切取插穗基部5 mm 長莖段用于石蠟切片的制備，石蠟切片的制備方法參見文獻[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpmiR156 的克隆與pGWB2?BpmiR156 過表達載體構(gòu)建

以白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，設(shè)計特異引物克隆包括miR156成熟序列的254 bp 的cDNA 序列，經(jīng)RT?PCR 擴增，在254 bp 處獲得與目標條帶的大小一致的特異條帶（如圖1a）。純化后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)TOPO 反應(yīng)后，所挑取的13 個單克隆中12 個檢測為陽性，表明目的基因已經(jīng)成功整合到了TOPO 載體上（見如圖1b），選取其中的2 個單克隆進行測序分析，測序結(jié)果證明已成功克隆目標序列。

圖1 白樺miR156 的克隆Fig.1 Cloning of B.platyphylla miR156 gene

提取經(jīng)檢測為陽性克隆的質(zhì)粒進行LR 反應(yīng)（圖2），挑取的5 個單克隆進行PCR 檢測均為陽性，目的基因miR156已成功構(gòu)建到了pGWB2載體上。

圖2 LR 反應(yīng)后菌液PCR 檢測電泳圖譜Fig.2 PCR detection electrophoresis pattern of bacterial liquid after LR reaction

2.2 轉(zhuǎn)BpmiR156 過表達白樺株系的獲得及PCR檢測

在不含抗生素的分化培養(yǎng)基上共培養(yǎng)經(jīng)侵染后的白樺合子胚，每天脫菌2～3 次，2～3 d 后使用加有50 mg/L 的潮霉素的選擇培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，期間不定期脫菌，15～20 d 后可見白樺合子胚切口處長有綠色的愈傷；待愈傷長到適宜大小，用刀片切下，置于分化培養(yǎng)基上，數(shù)日后淺黃色愈傷逐漸變?yōu)榫G色愈傷組織，慢慢形成不定芽；再經(jīng)過20～30 d 左右，不定芽逐漸分化長大形成叢生苗，叢生苗二次分化（圖3），最終獲得8 個超表達轉(zhuǎn)化子，分別命名為Oxm156?1～Oxm156?8。

圖3 miR156 轉(zhuǎn)化子的獲得及生長過程Fig.3 Obtaining and growth process of miR156 transformant

以非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗导稗D(zhuǎn)基因株系葉片DNA作為模板，分別以基因序列設(shè)計上游引物，以載體序列設(shè)計下游引物進行PCR 檢測，產(chǎn)物以1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系擴增出目標條帶，與陽性對照一致，而非轉(zhuǎn)基因白樺（WT）沒有擴增出條帶，說明miR156已成功整合到白樺基因組中（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)miR156 基因植株的PCR 檢測Fig.4 PCR test of miR156 transgenic lines

2.3 轉(zhuǎn)BpmiR156 過表達白樺株系扦插生根率

取2 年生轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档漠斈晟壑?，截取? 個芽點的莖段將其扦插到基質(zhì)中，此過程不加任何激素處理。30 d 后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：在相同培養(yǎng)條件下，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗登o段生根率為0，而轉(zhuǎn)miR156白樺株系扦插生根率高達80%以上（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)miR156 過表達白樺株系及WT扦插生根情況統(tǒng)計Fig.5 Rooting statistics of transgenic B.platyphylla lines with miR156 overexpression and WT cuttings

2.4 轉(zhuǎn)BpmiR156 過表達白樺株系不定根發(fā)生過程解剖觀察

通過石蠟切片分析轉(zhuǎn)miR156白樺扦插生根過程發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)miR156白樺當年生嫩枝莖段由周皮、維管束和皮層3 種組織系統(tǒng)構(gòu)成。莖段橫切面最外層為周皮，細胞排列緊密沒有空隙，細胞為長方形，周皮以下為皮層，皮層細胞較大而排列疏松。皮層內(nèi)由次生韌皮部、次生木質(zhì)部、維管形成層和髓組成，在次生韌皮部和次生木質(zhì)部內(nèi)，有由單列細胞輻射排列形成的的維管射線。由對未進行處理的莖段解剖觀察結(jié)果可知，在白樺的插穗中無先生根原基（圖6a）。

在扦插后第3 天時，解剖觀察發(fā)現(xiàn)莖段次生韌皮部外側(cè)處的維管射線細胞橫向分裂加寬，向髓心一側(cè)的維管射線仍為單列（見圖6b）。在扦插后第6 天時，觀察到在維管射線細胞加寬處形成了薄壁細胞團，這些薄壁細胞排列緊密，細胞核較大，易與周圍細胞區(qū)分開（見圖6c）。在扦插后的9 d 時，薄壁細胞團恢復分生能力之后，向著周皮方向發(fā)展，分化出了根原基發(fā)端細胞，這些根原基發(fā)端細胞細胞質(zhì)濃，染色更深（見圖6d）。在12 d 時，根原基發(fā)端細胞不斷分裂，形成體積較小的細胞，構(gòu)成了早期根原基，根原基首次突出表皮（見圖6e）。在15 d 時，根原基內(nèi)部出現(xiàn)明顯的分層，外層細胞圓周排列，形成如根冠一樣的保護結(jié)構(gòu)，以下是體積較小而排列緊密的分生細胞（見圖6f）。隨著分生細胞的不斷分裂和生長，根原基在發(fā)育過程中不斷擠壓外部的韌皮部、皮層和周皮，在18d 時，分化出來的根原基突破周皮,從周皮裂口處伸出（見圖6g）。在扦插第21 天時，不定根內(nèi)部分化出的的維管束與莖中維管束相連（見圖6h）。

圖6 轉(zhuǎn)miR156 過表達白樺株系不定根發(fā)生過程的解剖觀察Fig.6 Anatomical observation of the adventitious root formation process of the transgenic B.platyphylla line with miR156 overexpression

根據(jù)解剖觀察不定根的形成過程可知，轉(zhuǎn)miR156白樺嫩枝中不存在先成根原基，而是誘導生成根原基。在扦插生根過程中，不定根的產(chǎn)生屬于皮部生根類型，生根處沒有愈傷組織形成，愈傷組織起源及發(fā)育更晚，且愈傷組織中未見根原基發(fā)生。

3 結(jié)論與討論

扦插是優(yōu)良樹種營養(yǎng)繁殖的重要方式，不定根的生成是扦插成功的關(guān)鍵。不定根的發(fā)生受很多因素影響，但一般而言，不定根發(fā)生的能力隨植物幼年向成熟轉(zhuǎn)變而下降。而植物從幼年向成年的轉(zhuǎn)變是由miR156表達的減少誘導的。研究發(fā)現(xiàn)，miR156表達量升高的煙草（Nicotiana tabacum）35S：MdMIR156a6 植株在MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)13 d后，插條不定根數(shù)量是野生型的4 倍以上，且不定根發(fā)育速率明顯快于野生型植株，而miR156表達受到抑制的35S：MIM156 插條幾乎沒有觀察到不定根[17]。這一點在玉米[10]、擬南芥[18]、番茄（Solanum lycopersicum）[19]等中也已經(jīng)得到證實。在木本植物白樺中也發(fā)現(xiàn)，miR156過量表達顯著提高了白樺的生根率。這表明miR156在草本和木本植物中均參與了植物的不定根發(fā)生過程。miR156的靶基因是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子SPL（SQUAMOSA promoter binding protein-like）家族[20]，SPL家族具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域。miR156與其靶基因SPL在時間表達模式上相反：在植物幼苗期，miR156含量最高隨后降低，而SPL 的表達隨營養(yǎng)階段的轉(zhuǎn)變逐漸升高，即miR156通過負調(diào)控其靶基因的表達來誘發(fā)植物的時相轉(zhuǎn)變，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育[21?22]。在擬南芥中，過表達miR156轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)根數(shù)量是野生型的兩倍，而沉默miR156或過表達SPL 植株側(cè)根數(shù)量遠少于野生型[23]。

Xu 等[17]解剖觀察野生型、表達轉(zhuǎn)基因株系35S：MdMIR156a6 和表達35S：MIM156 煙草植株莖的連續(xù)橫截面發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，35S：MdMIR156a6 插條不定根原基的發(fā)生較快且發(fā)育良好。相反，在整個試驗過程中，35S：MIM156插條沒有觀察到不定根原基。本研究在解剖觀察過表達miR156轉(zhuǎn)基因白樺扦插不定根發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，與使用外源激素處理的野生型白樺嫩枝扦插時的不定根發(fā)生過程相比[24]，轉(zhuǎn)基因白樺維管射線細胞加寬過程的出現(xiàn)和薄壁細胞團的形成時間更早，維管射線細胞加寬到形成薄壁細胞團的時間更短，即根原基的誘導產(chǎn)生更早。另外，轉(zhuǎn)基因株系的射線細胞加寬處位于韌皮部外側(cè)，而在野生型白樺嫩枝扦插不定根形成的解剖觀察[22]中，觀察到射線細胞從形成層交叉處的位置加寬。

綜上所述，本研究在克隆了miR156成熟序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了pGWB2?miR156過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法成功獲得了8 個miR156過表達白樺株系。在相同的培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)miR156過表達白樺株系嫩枝扦插生根率遠高于野生型白樺株系，并在解剖層面上進一步驗證了轉(zhuǎn)miR156過表達白樺易生根，為miR156調(diào)控不定根發(fā)生提供理論基礎(chǔ)揭示提供新思路。但轉(zhuǎn)miR156過表達白樺株系在扦插不定根發(fā)生過程中，插條體內(nèi)的內(nèi)源激素、營養(yǎng)物質(zhì)、氧化酶活性等如何變化；miR156基因在分子層面上是如何誘導調(diào)控白樺嫩枝扦插生根的；這些問題還有待進一步研究探討。