氣相色譜法測(cè)定保健食品中肌醇含量的方法研究

劉文博

（山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心 藥品檢驗(yàn)技術(shù)研究所，山西太原 030031）

肌醇是微生物及動(dòng)物生長(zhǎng)的必要元素，可以從動(dòng)物的心肌和肝臟中分離取得，主要以磷脂的形式存在，又稱肌醇磷脂[1]。肌醇可以代謝清除肝臟脂肪和膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈硬化，并且供給腦細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)正常發(fā)絲的生長(zhǎng)[2]。由于肌醇的食物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化作用，多應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)功能飲品、嬰幼兒配方食物等保健食品中，此外在發(fā)酵和食品工業(yè)中，肌醇可用于多種菌種的培養(yǎng)和促進(jìn)酵母的增長(zhǎng)等作用[3]。目前，肌醇的檢測(cè)范圍主要包括保健食品如功能性飲料及嬰兒配方奶粉等，檢測(cè)方法主要有微生物法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和毛細(xì)管電泳法等，各種檢測(cè)方法有各自的特點(diǎn)與不適用性[4]。本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有設(shè)備條件，對(duì)GB 5009.196—2003[5]中氣相色譜法測(cè)定保健食品中的肌醇含量進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并探討了前處理過程中的關(guān)鍵點(diǎn)，旨在為今后相關(guān)部門開發(fā)出更為準(zhǔn)確精密、檢測(cè)范圍更廣的實(shí)驗(yàn)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樂虎功能性保健飲料（達(dá)利食品集團(tuán)有限公司）；國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)肌醇（純度為99.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；無水乙醇、正己烷、六甲基二硅氨烷、N,N-二甲基甲酰胺（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）；三甲基氯硅烷（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010 氣相色譜儀（附氫火焰檢測(cè)器，日本島津公司）；XS 105 微量天平（精度0.000 01g，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；EV311 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；101-1A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑溶液制備

肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：將肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥4 h，準(zhǔn)確稱量0.052 05 g 于100 mL 容量瓶中，以70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，配成0.520 5 mg/mL 肌醇溶液。

硅烷化試劑：分別量取一定量的三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷、二甲基甲酰胺，以1 ∶2 ∶8 的體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 供試品溶液制備

準(zhǔn)確量取樂虎試樣2.0 mL 于三角瓶中，加入70%的乙醇溶液，使其含肌醇濃度為0.5 mg/mL，超聲波提取10 min 后，在3 000 r/min 的條件下離心5 min，取出上清液備用。

準(zhǔn)確量取1.0 mL 試樣上清液于旋蒸瓶中，加入5 mL 無水乙醇，于60 ℃下旋蒸濃縮至近干，反復(fù)3 次，直至旋蒸瓶中液體完全除去。之后再向旋蒸瓶中加入5.0 mL 硅烷化試劑，使用超聲波提取器混勻瓶中內(nèi)容物。再置于70 ℃水浴中加熱10 min，靜置待其冷卻后加入10 mL 純化水，再加入3.0 mL 正己烷，振搖1 min 后靜置10 min，在3 000 r/min 下離心5 min，以滴管取出正己烷層，加入少許無水硫酸鈉，小幅度振搖后放置，取上清液上機(jī)待測(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列制備

分別吸取0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL 和4.0 mL 濃度為0.520 5 mg/mL 的肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 個(gè)10 mL 容量瓶中，以70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，配成濃度為0.010 41 mg/mL、0.020 82 mg/mL、0.052 10 mg/mL、0.104 10 mg/mL 和0.208 20 mg/mL的肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

準(zhǔn)確量取1.0 mL 上述肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于旋蒸瓶中，按1.3.2 中步驟操作，得到肌醇標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液，上機(jī)待測(cè)。

1.3.4 氣相色譜條件

色 譜 柱：BP-5 毛 細(xì) 管 柱（25 m×0.32 mm，0.25 μm）；柱溫：恒溫190 ℃；進(jìn)樣口溫度：245 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為1 ∶50；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：高純氮，流速為50 mL/min；檢測(cè)器：FID，空氣流量500 mL/min，氫氣流量40 mL/min，尾吹氣N2流量50 mL/min；色譜峰保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離分析

在1.3.4 色譜條件下，28 min 內(nèi)能完成標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液中肌醇的在線分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1，肌醇色譜峰尖銳對(duì)稱，與溶劑峰、雜質(zhì)峰能較好地分離，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行分析檢測(cè)。

圖1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件探討

2.2.1 水分對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

向兩份樂虎飲料中添加相同含量的肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中一份在旋蒸過程中水分揮發(fā)不完全，另一份完全蒸干水分，測(cè)定比較兩者的回收率，考察實(shí)驗(yàn)中水分的完全除去與否對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中水分未完全揮發(fā)的回收率為84.5%，水分揮發(fā)完全的回收率為100.1%，表明前處理中水分的完全除去與否對(duì)實(shí)驗(yàn)回收率影響較大。原因可能是當(dāng)旋蒸過程中水分揮發(fā)不完全，部分肌醇溶于水中未被提取出來，因此實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)確保烘干水分，可在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再將三角瓶放入烘箱中在75 ℃下烘干1 ～2 h，確保試樣中不含水分。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

向兩份樂虎飲料中添加相同含量的肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中一份在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)使用無水乙醇，另一份使用95%乙醇，測(cè)定比較兩者的回收率，考察實(shí)驗(yàn)中乙醇濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，旋蒸過程中使用無水乙醇時(shí)回收率為102.6%，使用95%乙醇時(shí)回收率為99.6%，均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008[6]要求的95%～105%范圍內(nèi)，表明旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中所用乙醇的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響并不大。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

將肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)樣于氣相色譜儀中，測(cè)定相對(duì)應(yīng)的峰面積，以峰面積為y軸，以進(jìn)樣濃度為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出線性回歸方程為y=1 615 898x-2 159，相關(guān)系數(shù)r=1，表明肌醇在0.010 41 ～0.208 2 mg/mL 呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。吸取0.01 mL 2.2.2 中的樂虎飲料加標(biāo)溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，以氣相色譜進(jìn)樣量5 μL作為檢測(cè)限，進(jìn)樣量10 μL 作為定量限，測(cè)得該方法的檢出限為0.20 μg/mL，定量限為0.98 μg/mL。

2.4 加標(biāo)回收率與重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取18 份0.25 g 的樂虎飲料試樣（經(jīng)本方法測(cè)得肌醇本底含量為0.098 mg）平均分為3 份，按照低、中、高3 種濃度水平分別加入0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 濃度為0.8 μg/mL 的肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液，按照1.3 實(shí)驗(yàn)方法將每種濃度水平進(jìn)行6 平行測(cè)試，計(jì)算方法的回收率與重復(fù)性RSD，結(jié)果見表1。樂虎飲料試樣中肌醇在0.083 3 ～0.124 9 mg 添加水平下，回收率在96.0%～104.7%，重復(fù)性RSD為1.37%～2.67%，表明本方法準(zhǔn)確度與重復(fù)性較好。

表1 肌醇的加標(biāo)回收率與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 方法的穩(wěn)定性考察

將濃度為53.865 ng/mL 的肌醇標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液分別于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 時(shí)按照1.3.4色譜條件進(jìn)行在線分析，考察方法的穩(wěn)定性，測(cè)得峰面積（uV·min）分別為10 905、10 728、11 221、11 256、11 329 和11 533，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.63%，表明肌醇衍生待測(cè)液在36 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，可以滿足多批次處理、儀器連續(xù)進(jìn)樣的需求。

3 結(jié)論

本研究對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.196—2003 中肌醇含量的測(cè)定方法進(jìn)行了驗(yàn)證，并探討了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中水分揮發(fā)程度及乙醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，旋蒸過程中水分必須完全除去，而乙醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。通過對(duì)方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率、重復(fù)性及穩(wěn)定性進(jìn)行考察，該方法符合GB 5009.196—2003 與GB/T 27404—2008 中的相關(guān)要求，可以滿足當(dāng)前食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室高通量、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)需求。