基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制

周 巧， 劉 健， 郭錦晨， 黃 旦

(1.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)風(fēng)濕病防治研究所，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素包括衰老、機(jī)械壓力、遺傳和肥胖[1]。骨關(guān)節(jié)炎中主要穩(wěn)態(tài)細(xì)胞的損害，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞功能障礙和衰老[2]。骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“骨痹”范疇，中醫(yī)學(xué)病機(jī)呈現(xiàn)脾虛濕盛、濕熱蘊(yùn)結(jié)，痰瘀痹阻，可采用“健脾化濕、清熱通絡(luò)”進(jìn)行治療，黃芩清熱除痹膠囊為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有健脾化濕、清熱通絡(luò)之功。本課題組前期臨床研究和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩清熱除痹膠囊可改善骨關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀，調(diào)節(jié)促-抑炎體系，發(fā)揮抗氧化作用，從而起到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的科學(xué)方法，分析網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)生物學(xué)是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)，與中醫(yī)的結(jié)合彌補(bǔ)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)之間的鴻溝[4]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出黃芩清熱除痹膠囊活性成分及作用靶點(diǎn)，挖掘黃芩清熱除痹膠囊調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)，并通過生物信息學(xué)分析，構(gòu)建藥物、靶點(diǎn)、基因、疾病網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行相應(yīng)富集分析和分子對(duì)接，探討黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎可能的分子機(jī)制，為黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究開拓思路，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 黃芩清熱除痹膠囊化學(xué)成分篩選及活性成分靶點(diǎn)庫構(gòu)建 通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)即TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索黃芩清熱除痹膠囊主要中藥成分黃芩、梔子、威靈仙、薏苡仁和桃仁，根據(jù) ADME(吸收、分布、代謝、排泄)的參數(shù)，口服生物利用度(OB)的篩查閾值設(shè)置為≥30%，藥物相似度(DL)設(shè)置為≥0.18，以篩選有效活性成分。

1.2 Venn分析及藥物活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將黃芩清熱除痹膠囊中藥成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫，限定物種是“Homosapiens”，獲得中藥化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn)基因，應(yīng)用UniProt校正，建立藥物活性成分靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫。以“Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD數(shù)據(jù)庫，篩選條件為relevance score≥10，收集與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的已知靶點(diǎn)基因。使用Funrich篩選中藥復(fù)方靶點(diǎn)和骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，進(jìn)行Venn分析。Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建黃芩清熱除痹膠囊活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)的篩選 將2組交集基因集輸入String在線數(shù)據(jù)庫，選擇“multiple proteins”分析模式，限定種屬為 “Homesapiens”，獲取蛋白與蛋白間互作信息，構(gòu)建PPI作用網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape 3.2.1軟件，使用CytoNCA插件[5]對(duì)核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選。

1.4 核心靶點(diǎn)基因的富集分析 使用R.Data軟件，對(duì)黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(GO)生物過程和KEGG信號(hào)通路富集分析，物種選為“Homesapiens”，以P<0.05作為篩選條件，獲取相應(yīng)數(shù)據(jù)，繪制相應(yīng)圖形。

1.5 活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇主要中藥成分化合物與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接?；衔锏亩S結(jié)構(gòu)圖通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載，導(dǎo)入到Chem3D軟件中以繪制三維結(jié)構(gòu)圖，優(yōu)化后保存為mol2格式，AutoDock Tools1.5.6軟件用于制備受體，包括添加氫和設(shè)置對(duì)接參數(shù)，所有配體和受體文件均保存為pdbqt格式，Autodock Vina來評(píng)估和驗(yàn)證化合物-靶標(biāo)關(guān)系的結(jié)合親和力，以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，綁定模型通過PyMol2.3.0軟件和Discovery Studio3.5軟件可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃芩清熱除痹膠囊有效成分的收集和篩選 最終獲得黃芩清熱除痹膠囊活性成分90種，其中黃芩36種，梔子15種，桃仁23種，威靈仙7種，薏苡仁9種，有2種成分為2種以上中藥所共有。由于黃芩清熱除痹膠囊的活性成分較多，僅列出25項(xiàng)，見表1。

2.2 黃芩清熱除痹膠囊和疾病骨關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點(diǎn)Venn分析及“中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)展示圖的構(gòu)建 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索黃芩清熱除痹膠囊活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，共得到1 767個(gè)靶標(biāo)基因，經(jīng)過Uniprot將所有靶標(biāo)進(jìn)行匯總、去除重復(fù)靶標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)化名稱，進(jìn)行校正后，共得到202個(gè)靶標(biāo)基因。通過檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD數(shù)據(jù)庫，分別收集到骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)基因1 836、33、353、8、28個(gè)，去除重復(fù)基因后共獲得1 944個(gè)。對(duì)黃芩清熱除痹膠囊活性成分對(duì)應(yīng)的202個(gè)共同作用靶點(diǎn)與1 944個(gè)骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行Venn分析，獲得115個(gè)交集基因，即為黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)。Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)展示圖，其中，左邊圓圈代表復(fù)方黃芩清熱除痹膠囊中藥的活性成分，不同顏色代表不同中藥成分，右邊網(wǎng)格代表活性成分的靶基因，用藍(lán)色長方形表示，節(jié)點(diǎn)越大，代表靶基因相連的成分越多，見圖1。

圖1 黃芩清熱除痹膠囊活性成分-作用靶點(diǎn)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)的篩選 將115個(gè)交集基因集輸入到Cytoscape 3.7.2軟件BisoGenet插件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。使用CytoNCA插件計(jì)算每個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的DC值，篩選出DC>2倍DC中位數(shù)(28)的節(jié)點(diǎn)。篩選出EC、IC、LAC、BC、CC、NE大于各自中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，最終篩選出核心靶點(diǎn)11個(gè)。分別為絲裂原活化蛋白激酶1,8,14(mitogen-activated protein kinase 1,8,14)、Fos原癌基因(Fos proto-oncogene)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞基(AP-1 transcription factor subunit)、雌激素受體(estrogen receptor 1，ESR1)、NFKB抑制劑α(NFKB inhibitor alpha，NFKBIA)、RELA原癌基因(RELA proto-oncogene)、NF-KB亞基(NF-KB subunit)、JUN(junctional adhesion molecule 3)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)、腫瘤蛋白P53結(jié)合蛋白1(tumor protein P53 binding protein 1，TP53)、MYC原癌基因(MYC proto-oncogene)、BHLH轉(zhuǎn)錄因子(BHLH transcription factor)。

表1 黃芩清熱除痹膠囊部分活性成分信息

注：左圖為初始PPI 網(wǎng)絡(luò)，中圖為篩選出DC>2倍DC中位數(shù)(28)的節(jié)點(diǎn)，右圖為最終篩選出的核心靶點(diǎn)。圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選過程圖

2.4 核心靶點(diǎn)基因的富集分析 為了解交集基因在骨關(guān)節(jié)炎治療中所起的作用，對(duì)黃芩清熱除痹膠囊的11個(gè)核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO、KEGG富集分析，設(shè)定閾值P<0.05。GO注釋條目116個(gè)，按照P值升序排列的前20條GO富集結(jié)果見圖3，生物過程(biological processes，BP)主要參與對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)、外在凋亡信號(hào)通路、對(duì)抗生素的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)；細(xì)胞組分(cellular component，CC)主要參與膜區(qū)、囊泡腔、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、分泌顆粒腔、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；分子功能(molecular function，MF)主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性、氧化還原酶活性等。按照P值升序排列的前20條KEGG富集通路見圖4，黃芩清熱除痹膠囊可以作用于IL-17信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等161條信號(hào)通路。此外，結(jié)果還顯示黃芩清熱除痹膠囊活性成分的靶基因還涉及其他疾病，如感染疾病、腫瘤、耐藥、內(nèi)分泌與代謝病和神經(jīng)退行性變等，這提示了黃芩清熱除痹膠囊活性成分治療這些疾病的潛在優(yōu)勢。

圖3 GO富集分析(前20條通路)

圖4 KEGG富集分析(前20條通路)

2.5 分子對(duì)接結(jié)果分析 通過篩選的11個(gè)核心靶點(diǎn)，以及富集分析得到的骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因和信號(hào)通路，選取有文獻(xiàn)報(bào)道與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)經(jīng)典靶點(diǎn)蛋白7個(gè)[6-11]，在PDB和Uniprot數(shù)據(jù)庫中檢索核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的與中藥成分相關(guān)的小分子配體，以及配體對(duì)應(yīng)的蛋白信息，物種選為“Homesapiens”，見表2。利用Autodock tools軟件計(jì)算這7個(gè)靶點(diǎn)基因與黃芩清熱除痹膠囊中藥活性成分間的最低結(jié)合能，見表3，受體蛋白與活性成分的最低結(jié)合能結(jié)果小于-5 kcal/mol，表明結(jié)合較好，所需的能量越少，結(jié)合越穩(wěn)定。部分分子對(duì)接結(jié)合模式見圖5，黃色圓圈表示小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)之間的對(duì)接狀態(tài)，綠色線條代表氫鍵。結(jié)果顯示，活性成分與靶點(diǎn)受體蛋白周圍分子通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。

表2 靶點(diǎn)受體蛋白信息

表3 活性成分與靶點(diǎn)受體蛋白間的最低結(jié)合能

注：A～D分別為梔子與ESR1、TP53、AKT1、MAPK14對(duì)接，E～F分別為黃芩與JUN、FOS對(duì)接，G為薏苡仁與MAPK1對(duì)接。圖5 活性成分與靶點(diǎn)受體蛋白的分子對(duì)接模式

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的特征是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的逐漸破壞[12]，本病中醫(yī)屬于“骨痹”范疇，其中醫(yī)學(xué)病機(jī)呈現(xiàn)脾虛濕盛、濕熱蘊(yùn)結(jié)，痰瘀痹阻[13]，因此采用健脾化濕、清熱通絡(luò)法治療[14]。黃芩清熱除痹膠囊具有健脾化濕、清熱通絡(luò)之功，由黃芩、梔子、威靈仙、薏苡仁、桃仁組成。本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索出黃芩清熱除痹膠囊的主要化學(xué)成分有90種，構(gòu)建黃芩清熱除痹膠囊-活性成分-潛在靶點(diǎn)以及骨關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)，通過Venn分析取兩者交集基因115個(gè)；PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點(diǎn)11個(gè)，包括MAPK1,8,14、AKT1、ESR1、TP53、JUN、FOS等；構(gòu)建“中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)；富集結(jié)果顯示，黃芩清熱除痹膠囊參與氧化應(yīng)激的反應(yīng)、活性氧的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子活性等生物過程；可以作用于IL-17信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號(hào)通路等161條信號(hào)通路，由此可見，黃芩清熱除痹膠囊可以調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的外在凋亡信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)。本課題組前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，黃芩清熱除痹膠囊可通過調(diào)節(jié)促-抑炎體系，調(diào)節(jié)CD36啟動(dòng)子或者PPARγ表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)MPK磷酸化，提高細(xì)胞內(nèi)Mn-SOD表達(dá)，使細(xì)胞免受氧化損傷，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗免疫作用，改善關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀[15-17]。這與本研究的富集結(jié)果相吻合。富集結(jié)果還顯示，黃芩清熱除痹膠囊活性成分的靶基因還涉及其他疾病，如感染疾病、腫瘤、耐藥、內(nèi)分泌與代謝病和神經(jīng)退行性變等，這提示了黃芩清熱除痹膠囊活性成分治療這些疾病的潛在優(yōu)勢。

對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋泻Y選的核心基因進(jìn)行選擇，選取有文獻(xiàn)報(bào)道與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)經(jīng)典靶點(diǎn)蛋白7個(gè)進(jìn)行分子對(duì)接，分別為ESR1、TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK14、FOS，與這些靶點(diǎn)相關(guān)的黃芩清熱除痹膠囊成分是黃芩、梔子、薏苡仁和威靈仙，且AutoDock Tools計(jì)算出的最低結(jié)合能結(jié)果均小于-5 kcal/mol，表示結(jié)合穩(wěn)定。故黃芩清熱除痹膠囊可以通過ESR1、TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK14、FOS等靶點(diǎn)治療骨關(guān)節(jié)炎。雌激素受體1(estrogen receptor,ESR) 是一種小分子類固醇激素，該基因多態(tài)性與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病有一定聯(lián)系，ESR1基因突變可能會(huì)增加膝骨關(guān)節(jié)炎患病風(fēng)險(xiǎn)。TP53基因編碼的p53蛋白的作用是調(diào)控細(xì)胞分裂和增殖。JUN和FOS是編碼激活蛋白-1(AP-1)的不同亞單位，含有FOS的AP-1雜二聚體被證明是軟骨細(xì)胞分化所必需的。另外，JUN表達(dá)的c-Jun蛋白對(duì)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡有重要作用[10]。MAPK蛋白等通過調(diào)控自噬相關(guān)信號(hào)通路,一方面抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減少軟骨細(xì)胞產(chǎn)生；一方面改變細(xì)胞生長環(huán)境促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡，增加軟骨細(xì)胞的損失，而軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少又伴隨著軟骨細(xì)胞外基質(zhì)生成不足，從而促進(jìn)軟骨退變[11]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，展示了黃芩清熱除痹膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的治病特點(diǎn)。研究還發(fā)現(xiàn)黃芩清熱除痹膠囊參與骨關(guān)節(jié)炎活性氧的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子活性等生物過程，也可以作用于IL-17信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用來治療骨關(guān)節(jié)炎。