類葉升麻苷對(duì)疊氮鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體凋亡的保護(hù)作用

高 莉， 李建梅， 阿娜古麗·馬合木提， 閆 明

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011)

大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病都存在神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能異常、細(xì)胞骨架的破壞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等與腦內(nèi)線粒體功能障礙密切相關(guān)的重要病理生理改變[1-2]，其中細(xì)胞色素C氧化酶(即線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ，COX)作為線粒體的標(biāo)志酶，是維持線粒體功能，進(jìn)行細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵，它的缺陷被認(rèn)為可能是神經(jīng)退行性疾病的特異改變[3-4]。疊氮鈉(NaN3)是COX的抑制劑，用NaN3損傷PC12細(xì)胞或神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，可劑量依賴性地使COX活性下降，造成細(xì)胞線粒體功能障礙，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致多種凋亡因子的釋放和細(xì)胞膜的損傷，引起細(xì)胞死亡[5]。

類葉升麻苷是苯乙醇苷類化合物，在洋丁香、車前草、肉蓯蓉等79種植物中廣泛存在，資源豐富，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、改善認(rèn)知障礙等多種功效[6-7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，類葉升麻苷具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)ADP/ATP比值以及保護(hù)神經(jīng)元的作用，但其是否通過線粒體保護(hù)途徑[8-9]發(fā)揮作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)以NaN3誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立線粒體損傷細(xì)胞模型，探討類葉升麻苷對(duì)線粒體損傷的細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響。

1 材料

1.1 試劑與藥物 類葉升麻苷(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制，批號(hào)20130401，純度≥98%)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Thermo公司)；氨芐青霉素鈉、硫酸鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)；MTT(美國(guó)Sigma公司)；乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；細(xì)胞色素C氧化酶(COX)活性檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；anti-Bax抗體、anti-Bcl-2抗體、anti-caspase-3抗體、anti-caspase-9抗體、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。疊氮鈉(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120618，純度≥99%)；丙酮酸鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 YJ-875型超凈工作臺(tái)(上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司)；37XB型倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器六廠)；MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱(北京索萊寶科技有限公司)；Multiskan Go 1510型酶標(biāo)儀、LEGEND MICRO 21R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Nanodrop little型核酸濃度檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)；FACS Aria Ⅱ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；GeneAmp PCR system 9700型PCR儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)；125-BR垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 細(xì)胞 鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞以5×104/mL密度接種于含10%胎牛血清、0.11 g/L丙酮酸鈉、2.5 g/L葡萄糖、1.5 g/L NaHCO3、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換傳代1次。

2.2 模型建立 以MTT值為指標(biāo)，細(xì)胞存活率達(dá)到40%～60%作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。將細(xì)胞接種于96孔板，待70%～80%融合時(shí)加入NaN3，使其終濃度分別為0、50、100、200 mmol/L，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用MTT法計(jì)算細(xì)胞存活率，確定NaN3劑量。

2.3 類葉升麻苷與NaN3損傷PC12細(xì)胞共孵育 培養(yǎng)貼壁PC12細(xì)胞，吹打懸浮后以5×104/mL密度接種到96孔板或細(xì)胞瓶中(空白組不含細(xì)胞，加入等體積PBS溶液)，培養(yǎng)過夜，待70%～80%融合時(shí)吸取原培養(yǎng)液，模型組、給藥組加入150 μL含100 mmol/L NaN3的1640培養(yǎng)液(空白組加入等體積不含NaN3的PBS溶液，對(duì)照組加入等體積不含NaN3的培養(yǎng)液)，在37 ℃下恒溫孵育4 h后，吸取各組培養(yǎng)液，給藥組再加入200 μL含有不同濃度(1、10、100 μmol/L)類葉升麻苷的培養(yǎng)液(空白組加入等體積PBS溶液，對(duì)照組及模型組加入等體積培養(yǎng)液)孵育24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并取樣進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h，空白組每孔加入20 μL PBS溶液，其余組每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，空白組每孔加入150 μL PBS溶液，其余組每孔加入等體積DMSO，振蕩溶解后，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH酶活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，按“2.3”項(xiàng)下方法分組給藥，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每組10孔，按照試劑盒說明書檢測(cè)LDH活性。

2.6 細(xì)胞線粒體COX活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，培養(yǎng)于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，按“2.3”項(xiàng)下方法分組給藥，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書檢測(cè)COX活性，重復(fù)4次，檢測(cè)總蛋白濃度后，待測(cè)樣品以50 μg總蛋白為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法，以RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5×104/mL，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)中48 h，加入100 mmol/L NaN3損傷4 h，按“2.3”項(xiàng)下方法分組給藥，將細(xì)胞自瓶壁上輕輕吹打下來，制成單細(xì)胞懸液后移入離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入預(yù)冷PBS清洗3次，Binding Buffer重懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，加入FITC標(biāo)記的Annexin V、PI溶液各5 μL，輕輕混勻，室溫避光染色20 min，加入Binding Buffer 400 μL，混勻，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.8 細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按“2.3”項(xiàng)下方法分組給藥，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，采用5%濃縮膠、10%分離膠進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉溶液封閉2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，1×TBST洗滌，二抗(1∶3 000)孵育1 h，1×TBST洗滌，按1∶1比例避光加入發(fā)光液，立即用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，保存成像條帶，進(jìn)行定量分析，重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 NaN3對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)情況及細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組比較，50、100、200 mmol/L NaN3作用4 h后，細(xì)胞形態(tài)均有不同程度的損傷，并隨著劑量增加更明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目減少，軸突縮短、減少、消失，細(xì)胞變圓(圖1A)，其中100、200 mmol/L NaN3組細(xì)胞存活率降低(P<0.01)，細(xì)胞線粒體還原MTT的能力分別為對(duì)照組的(62.76±2.38)%、(40.64±6.45)%(圖1B)。根據(jù)損傷程度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇造模條件為100 mmol/L NaN3作用PC12細(xì)胞4 h。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。圖1 NaN3對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)(A)及存活率(B)的影響

3.2 類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷后PC12細(xì)胞存活率和細(xì)胞膜損傷的影響 如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞數(shù)減少，形態(tài)變圓變小，扁平，無光澤，軸突消失，細(xì)胞存活率降低(P<0.01)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH酶活性升高(P<0.01)；與模型組比較，類葉升麻苷各劑量組細(xì)胞梭形、軸突、立體光澤等形態(tài)特征恢復(fù)，細(xì)胞存活率升高(P<0.01)，細(xì)胞上清液中LDH釋放量降低(P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷后PC12細(xì)胞形態(tài)(A)、細(xì)胞存活率(B)及細(xì)胞膜損傷(C)的影響

3.3 類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷后PC12細(xì)胞線粒體COX活性的影響 圖3顯示，與對(duì)照組比較，細(xì)胞經(jīng)NaN3損傷后線粒體COX活性受到抑制(P<0.01)；與模型組比較，1、10、100 μmol/L類葉升麻苷組細(xì)胞COX活性升高(P<0.05，P<0.01)，并且劑量越低，效果越明顯。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖3 類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷后PC12細(xì)胞線粒體COX活性的影響

3.4 類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷后PC12細(xì)胞凋亡的影響 圖4顯示，對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率為(3.774±0.894)%，而模型組細(xì)胞與100 mmol/L NaN3共孵育4 h后增至(34.805±2.857)%(P<0.01)；與模型組比較，類葉升麻苷各劑量組細(xì)胞早期凋亡率均降低(P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.5 類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷后PC12細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)的影響 圖5顯示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，類葉升麻苷各劑量組細(xì)胞Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。

4 討論

神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森氏病和亨廷頓病等的發(fā)生與腦內(nèi)線粒體缺陷密切相關(guān)，其患者體內(nèi)均存在線粒體功能和線粒體DNA的異常，這一觀點(diǎn)已得到廣泛認(rèn)同[10-11]。目前研究發(fā)現(xiàn)COX活性在阿爾茨海默病患者中下降30%～40%[12]，且有研究證實(shí)輕度認(rèn)知障礙患者和阿爾茨海默病患者腦內(nèi)葡萄糖代謝紊亂導(dǎo)致腦能量代謝降低，并由此影響腦功能正常發(fā)揮，造成學(xué)習(xí)記憶能力缺陷[13]。

COX的特異性抑制劑NaN3作為工具藥已被廣泛地應(yīng)用于制備模擬阿爾茨海默病的細(xì)胞和動(dòng)物模型。研究證明，它可以損傷神經(jīng)細(xì)胞使動(dòng)物產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶障礙，其作用機(jī)制可能包括神經(jīng)細(xì)胞骨架損傷、氧化損傷、離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞、細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞凋亡和壞死等[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中選擇不同劑量NaN3與PC12細(xì)胞共同孵育4 h，通過考察細(xì)胞存活率，確定了在本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，采用100 mmol/L NaN3損傷PC12細(xì)胞4 h后PC12細(xì)胞存活率大約為60%的造模條件，確保了細(xì)胞模型既有損傷又能保證損傷不至于影響研究類葉升麻苷的藥效作用。實(shí)驗(yàn)中建立的造模條件與文獻(xiàn)[5,16]報(bào)道的作用劑量和作用時(shí)間基本相似。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷后PC12細(xì)胞凋亡的影響

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖5 類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷后PC12細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)在建立NaN3造模條件的基礎(chǔ)上，研究不同劑量類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷PC12細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量類葉升麻苷呈劑量依賴性地恢復(fù)PC12細(xì)胞受到的NaN3損傷，不同程度恢復(fù)PC12細(xì)胞的梭形、軸突等特征，提高細(xì)胞的存活率，增加COX活性。類葉升麻苷對(duì)細(xì)胞COX活性的影響呈現(xiàn)隨劑量降低效果增強(qiáng)的趨勢(shì)，一方面表明類葉升麻苷在改善NaN3抑制COX活性作用方面起效劑量低；另一方面也表現(xiàn)出類葉升麻苷抑制COX活性的作用時(shí)效可能較快，在較高劑量下也許可以快速調(diào)節(jié)細(xì)胞中COX活性抑制的狀態(tài)，并在作用24 h檢測(cè)之前，已經(jīng)快速解除了COX活性抑制的狀態(tài)，激發(fā)了機(jī)體自我平衡的反饋抑制機(jī)制的反應(yīng)。鑒于類葉升麻苷對(duì)于COX活性調(diào)節(jié)的敏感性，在今后的研究中，不僅應(yīng)對(duì)其量效關(guān)系進(jìn)行研究，更應(yīng)開展其時(shí)效關(guān)系的深入研究。

線粒體可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)凋亡通路的發(fā)生，當(dāng)線粒體功能受到損傷時(shí)，其膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C，導(dǎo)致csapase-9活化，引起caspase通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過線粒體凋亡途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡[17-18]。NaN3制備PC12線粒體損傷模型可以較好地模擬這一病理變化[19]。LDH是反映細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)，可以直接反應(yīng)細(xì)胞膜的完整性和通透性，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性，可以間接反應(yīng)細(xì)胞的受損情況。流式細(xì)胞技術(shù)是目前研究細(xì)胞凋亡較靈敏和全面的實(shí)驗(yàn)方法。因此，實(shí)驗(yàn)中采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷PC12細(xì)胞凋亡的作用，并采用Western blot方法對(duì)線粒體凋亡途徑相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞經(jīng)NaN3損傷后，LDH的釋放量增加，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡，凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)升高以及抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)降低，然而將1、10、100 μmol/L類葉升麻苷與模型細(xì)胞共孵育24 h后，類葉升麻苷能降低PC12細(xì)胞的LDH釋放量，提高正常細(xì)胞比例和降低細(xì)胞早期凋亡率，降低細(xì)胞Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)以及升高Bcl-2蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性。提示，類葉升麻苷對(duì)NaN3損傷PC12細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性和通透性具有保護(hù)作用，對(duì)線粒體受損PC12細(xì)胞的晚期凋亡無作用，但對(duì)細(xì)胞早期凋亡有抑制作用，能夠通過介入線粒體凋亡途徑改善模型細(xì)胞的早期凋亡增加的現(xiàn)象。

綜上所述，類葉升麻苷拮抗NaN3損傷細(xì)胞的機(jī)制可能為NaN3通過抑制COX活性導(dǎo)致線粒體跨膜電位降低，能量供應(yīng)不足，引起細(xì)胞骨架的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)細(xì)胞的存活和增殖。類葉升麻苷能夠通過改善和保護(hù)線粒體功能起到防治線粒體功能障礙的神經(jīng)退行性等疾病的作用，對(duì)此類疾病治療具有一定的應(yīng)用前景。