香葉木素自微乳的制備

趙藝寧， 韓葉楓， 梁建坤， 劉曉娟

(錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

香葉木素存在于菊花、留蘭香、蜘蛛香等天然藥物和檸檬、柑橘、花生等果實(shí)中，是天然黃酮類化合物[1]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎，抑制細(xì)胞凋亡等作用，被廣泛用作靜脈血管疾病(如下肢靜脈潰瘍、痔瘡)的血管保護(hù)劑[2]。但該成分在水中的溶解度較低，并且人體內(nèi)存在肝-腸循環(huán)以及腸-腸循環(huán)，高首過效應(yīng)使其口服吸收差，體內(nèi)生物利用度低，從而限制了相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)與臨床應(yīng)用。

自微乳是難溶性藥物增溶研究的熱點(diǎn)之一，它由油相、乳化劑、助乳化劑按適當(dāng)比例組成，在適宜水相中溫和攪拌的情況下，可自乳化成粒徑小于100 nm的O/W 型熱力學(xué)穩(wěn)定的油水混合系統(tǒng)[3]，能增加藥物膜滲透性，促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，避免首過效應(yīng)，從而有效改善藥物生物利用度，掩蓋不良?xì)馕?，減少對胃腸道的刺激性。本實(shí)驗(yàn)將香葉木素制成自微乳，以期提高該成分口服吸收利用度。

1 材料

香葉木素(批號EG110090，薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司)。油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；油酸聚乙二醇甘油酯、中鏈甘油酸酯、丙二醇月桂酸酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、乙二醇單乙基醚(德國Sasol公司)；單亞油酸甘油酯(法國Gattefosse公司)；橄欖油、蓖麻油聚氧乙烯醚(上海麥克林生化科技有限公司)；吐溫80(天津天力化學(xué)試劑有限公司)；聚乙二醇400(蘇州華晨化工有限公司)。異丙醇(天津水晟精細(xì)化工有限公司)；甲醇(天津大茂化學(xué)試劑廠)；1,2-丙二醇(天津永晟精細(xì)化工有限公司)。

TD型電子天平(上海托利多儀器有限公司)；KQ-300V型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；WH-2微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)；TGL-16高速離心機(jī)(江蘇金壇市中大儀器廠)；UV2550紫外可見分光光度計(jì)(日立島津公司)；95-1雙向磁力加熱攪拌器(德國IKA公司)；RC-8溶出度測試儀(天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司)；康氏振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；Nano-ZS90激光粒度儀(日立高新技術(shù)集團(tuán))；JEM-1400Flash透射電鏡(日本電子株式公社)。

2 方法與結(jié)果

2.1 香葉木素含量測定

2.1.1 檢測波長確定 精密稱取香葉木素原料藥25 mg，甲醇稀釋至5 mg/mL，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[4]，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長為343 nm。將載體材料在上述最大吸收波長下進(jìn)行紫外檢測，發(fā)現(xiàn)它無吸收干擾，對含量測定無影響，故選擇其作為檢測波長。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取香葉木素對照品25 mg至50 mL量瓶中，甲醇超聲溶解，定容，搖勻，制成貯備液，精密量取25、50、75、100、125、150 μL至10 mL量瓶中，制成對照品溶液，在343 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.098 5X+0.073(R2=0.999 6)，在1.25～7.50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 分別吸取低(2.5 μg/mL)、中(5 μg/mL)、高(7.5 μg/mL)質(zhì)量濃度對照品溶液適量，同一天內(nèi)在343 nm波長處測定吸光度5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；每天于同一時(shí)間點(diǎn)測定1次，連續(xù)5 d，計(jì)算日間精密度，測得前者RSD分別為0.58%、0.20%、0.19%，后者RSD分別為0.35%、0.23%、0.13%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取香葉木素對照品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備3.75 μg/mL溶液，在343 nm波長處測定吸光度6次，測得其RSD為0.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別在不同質(zhì)量濃度對照品溶液中加入一定量空白自微乳，混勻后加入甲醇破乳，測得加樣回收率分別為98.69%、99.60%、99.16%，RSD分別為0.59%、0.72%、0.79%。

2.2 溶解度測定 取油相、乳化劑、助乳化劑各4 mL至EP管中，加入過量香葉木素，混勻后超聲處理2 h，于37 ℃恒溫水浴振蕩器中放置48 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，甲醇稀釋至適宜質(zhì)量濃度，在343 nm波長處測定吸光度，計(jì)算溶解度[5]，結(jié)果見表1。由此可知，香葉木素在油相中的溶解度依次為為橄欖油>油酸乙酯>肉豆蔻酸異丙酯>油酸聚乙二醇甘油酯>中鏈甘油酸酯，在乳化劑中的溶解度依次為吐溫80>辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯>蓖麻油聚氧乙烯醚>單亞油酸甘油酯>丙二醇月桂酸酯，在助表面活性劑中的溶解度依次為聚乙二醇400>1,2-丙二醇>乙二醇單乙基醚>異丙醇。最終，選擇橄欖油、油酸乙酯作為油相，吐溫80作為乳化劑，聚乙二醇400作為助乳化劑。

表1 香葉木素在各輔料中的溶解度

2.3 油相篩選 將吐溫80與聚乙二醇400按質(zhì)量比(Km)1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1混勻后，再與橄欖油按Km1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1振蕩混勻，量取1 mL至燒杯中，緩慢加水滴定，稀釋至50倍，觀察溶液澄清度，同時(shí)記錄乳化時(shí)間[6]。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將橄欖油作為油相時(shí)加水乳化后，溶液表面有少量油狀漂浮物，比較渾濁，證明橄欖油未乳化完全，故選擇油酸乙酯作為油相。

2.4 偽三元相圖繪制

2.4.1Km值篩選 將乳化劑與助乳化劑按Km1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1振蕩混勻后，再與油酸乙酯按Km1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1振蕩混勻，固定體系總體積為1 mL，緩慢滴入水相，記錄溶液由渾濁變?yōu)槌吻鍟r(shí)臨界點(diǎn)的加水量[7]。采用Orgin 8.5軟件繪制偽三元相圖，以乳化劑、油相、水為3個(gè)頂點(diǎn)，確定成乳區(qū)域，結(jié)果見圖1。

圖1 偽三元相圖

在低含水量、高表面活性劑的條件下，磁轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)較緩慢，液體濃稠，顏色為黃色，不符合形成微乳的條件，經(jīng)判斷未成乳。隨著加水量不斷增加，溶液逐漸澄清透明，微泛藍(lán)光，符合微乳的篩選條件，各區(qū)均延伸到水相頂點(diǎn)，即可被水無限稀釋。滴入水相后，在不同Km下溶液顏色均澄清透明，顏色輕微泛藍(lán)。圖1中乳化區(qū)域影面積越大，乳化時(shí)間越短，代表成乳效果越好；Km為1∶2、1∶1時(shí)，乳化時(shí)間較長，故選擇2∶1、3∶1、4∶1進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4.2 油相用量篩選 固定油相、乳化劑、助乳化劑體系1 mL，加入100倍純化水，發(fā)現(xiàn)當(dāng)油相用量小于10%時(shí)，形成的乳液為粗乳液，即表面有無法乳化的液滴，溶液顏色不澄清；當(dāng)其用量大于50%時(shí)，有大量油滴懸浮在溶液中，難以形成微乳液。 因此，選擇油相用量為10%～50%，此時(shí)可得到澄清透明、均一穩(wěn)定的微乳液。

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法 取自微乳適量，純化水稀釋100倍，采用粒徑分析儀測定其粒徑、Zeta電位；100 r/min進(jìn)行磁力攪拌，測定乳化時(shí)間(溶液上層無油狀漂浮物，比較澄清，微泛藍(lán)光，即為完全乳化)。

在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇油相用量(X1)、乳化劑比例(X2)作為影響因素，平均粒徑(Y1)、Zeta電位(Y2)、乳化時(shí)間(Y3)作為評價(jià)指標(biāo)[8]，因素水平見表2，再采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行處方優(yōu)化，結(jié)果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖2。由此可知，當(dāng)Km保持中間水平不變時(shí)，隨著油相用量增加，粒徑、乳化時(shí)間均呈先降后升的趨勢，而Zeta電位呈逐漸升高的趨勢；當(dāng)Km、油相用量最大時(shí)，粒徑、Zeta電位、乳化時(shí)間均達(dá)到峰值。由于篩選自微乳處方時(shí)，應(yīng)滿足乳化后粒徑小、Zeta電位絕對值高、乳化時(shí)間短的要求，故因素X1、X2最終取值分別為22.82、2.37，即最優(yōu)處方為油酸乙酯用量22.82%，吐溫80用量54.28%，聚乙二醇400用量22.90%。

表4 平均粒徑方差分析

表5 Zeta電位方差分析

表6 乳化時(shí)間方差分析

圖2 各評價(jià)指標(biāo)響應(yīng)面圖

根據(jù)上述處方進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表7，可知實(shí)測值與預(yù)測值的偏差較小，表明該處方穩(wěn)定可行，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法預(yù)測結(jié)果良好。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.7 自微乳質(zhì)量評價(jià)

2.7.1 飽和載藥量測定 按“2.6”項(xiàng)下最優(yōu)處方制備自微乳1 mL，加入過量香葉木素原料藥，超聲處理2 h助溶，置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中48 h，10 000 r/min離心10 min，上清液用甲醇稀釋100倍，在343 nm波長處測定吸光度[9]，測得飽和載藥量為(59.44±0.20)mg/mL。

2.7.2 溶解度測定 按“2.6”項(xiàng)下最優(yōu)處方制備自微乳1 mL，加入純化水稀釋100倍，取2 mL至具塞管中，加入過量香葉木素原料藥，混勻后渦旋5 min，按“2.2”項(xiàng)下方法測定溶解度。結(jié)果，自微乳在水中的溶解度為54.50 μg/mL，而原料藥僅為1.05 μg/mL，即提高了52倍。

2.7.3 粒徑、Zeta電位測定 制備自微乳適量，加入純化水稀釋100倍，采用激光粒度儀測定粒徑、Zeta電位，結(jié)果見圖3～4。由此可知，平均粒徑為(17.46±0.29)nm，Zeta電位為(-22.67±0.15)mV，PDI為0.066±0.002，并且粒徑較小，分布較集中。

圖3 自微乳粒徑分布

圖4 自微乳Zeta電位

2.7.4 形態(tài)觀察 取自微乳適量，在37 ℃水浴中用100倍純化水稀釋，輕微攪拌混合均勻，取少量至銅網(wǎng)上，靜置5 min，滴加2%磷鎢酸溶液負(fù)染5 min，濾紙吸去負(fù)染色液，室溫晾干，在透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)，結(jié)果見圖5。由此可知，乳滴粒徑大小均一，分布均勻，無粘連。

2.7.5 穩(wěn)定性研究 對自微乳進(jìn)行溫度穩(wěn)定性(在4、25、60 ℃下避光保存)、強(qiáng)光照射穩(wěn)定性[在25 ℃、(4 500±500)lx下保存][10]試驗(yàn)，于第0、5、10天觀察外觀，測定香葉木素含量，結(jié)果見表8～9。由此可知，在4、25 ℃下自微乳及其乳化后溶液澄清，香葉木素含量無明顯變化，但在60 ℃下兩者顏色變深，第5、10天時(shí)該成分含量分別降低11.24%、19.95%；在強(qiáng)光照射下，自微乳及其乳化后溶液澄清，但隨著時(shí)間延長香葉木素含量也明顯降低。綜上所述，自微乳應(yīng)低溫避光保存。

圖5 自微乳透射電鏡圖

表8 溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表9 強(qiáng)光照射穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.7.6 體外溶出度研究 按“2.6”項(xiàng)下最優(yōu)處方制備自微乳0.5 mL，并裝入膠囊中，使其最終載藥量為25 mg；另取香葉木素原料藥25 mg，也裝入膠囊中。采用2020年版《中國藥典》四部通則0931溶出度測定法第一法(籃法)，以900 mL蒸餾水為溶出介質(zhì)，設(shè)定水浴溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于1、2、5、10、20、30、45、60 min各取樣5 mL(取樣后及時(shí)補(bǔ)充溶出介質(zhì))，在343 nm波長處測定吸光度，計(jì)算累積溶出度[11-12]，結(jié)果見圖6。由此可知，自微乳膠囊釋藥迅速完全，10 min內(nèi)累積溶出度即達(dá)80%以上，而原料藥膠囊釋藥緩慢，表明自微乳可有效提高藥物溶出速度。

圖6 香葉木素體外溶出曲線

3 討論

自微乳釋藥系統(tǒng)是O/W型熱力學(xué)穩(wěn)定的油水混合系統(tǒng)，其中乳化劑的選擇是自微乳處方關(guān)鍵，若其用量過多，則會對胃腸黏膜產(chǎn)生一定的刺激，引起胃腸道不適；用量過少，則藥物進(jìn)入胃腸道后乳化形成的乳滴粒徑較大，對微乳穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。因此，乳化劑用量需適宜，并且盡可能選擇毒性較低、同時(shí)乳化能力較高者[13]。

自微乳中油相能提高藥物的溶解能力，促進(jìn)藥物乳化，同時(shí)還可刺激胃腸道產(chǎn)生脂蛋白和乳糜微粒，增加藥物淋巴吸收途徑及旁路轉(zhuǎn)運(yùn)，避免首過效應(yīng)，間接提高藥物生物利用度[14]。本實(shí)驗(yàn)篩選香葉木素自微乳處方，發(fā)現(xiàn)對該成分溶解度較大的油相有橄欖油和油酸乙酯，但與乳化劑、助乳化劑配伍時(shí)，后者能與吐溫80、聚乙二醇400形成微乳，而前者無法乳化完全，溶液上層有油滴狀漂浮物，并且乳化時(shí)間長。因此，選擇油酸乙酯作為香葉木素自微乳油相。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是效應(yīng)面法中最常用的一種優(yōu)化方法，廣泛應(yīng)用于藥劑學(xué)領(lǐng)域，它集數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)方法于一體，比常用均勻設(shè)計(jì)、正交試驗(yàn)更全面，實(shí)驗(yàn)精度更高，實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，能靈敏地反映各因素之間的交互作用，適用于多因素多水平實(shí)驗(yàn)，也是藥物制劑處方工藝優(yōu)化手段之一[15]。本實(shí)驗(yàn)針對難溶性天然黃酮類化合物香葉木素，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化其自微乳處方，預(yù)測效果良好。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)先通過測定溶解度、繪制偽三元相圖，初步篩選香葉木素自微乳處方，再采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對其進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果，所得自微乳加入水相后溶液呈淡黃色，表面無油滴漂浮，平均粒徑為(17.46±0.29)nm，長時(shí)間放置性質(zhì)穩(wěn)定，與原料藥比較，其藥物溶解度與溶出速度顯著提高，可為相關(guān)制劑研發(fā)提供參考，對水難溶性、脂溶性藥物自微乳釋藥系統(tǒng)的研究也具有重要意義，具有一定的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。