人參皂苷化學(xué)轉(zhuǎn)化與生物轉(zhuǎn)化研究進展

陳思鍵， 吳冬雪， 劉淑瑩,2， 趙幻希*， 修 洋*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春 130022)

人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，主產(chǎn)于中國東北、韓國、俄羅斯遠(yuǎn)東等地區(qū)，是我國的新資源食品和藥食同源的中藥材品種。人參被收錄于2020年版《中國藥典》[1]。《美國藥典》也收錄了人參的貯藏條件和飲食攝入量等信息[2]。人參含有多種化學(xué)成分，如人參皂苷、人參多糖、揮發(fā)油、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等[3]。其中，人參皂苷是人參的主要活性成分，具有調(diào)節(jié)血糖[4]、抗腫瘤[5]、抗應(yīng)激[6]、保護神經(jīng)[7]等活性。人參皂苷由皂苷元和糖基取代基組成，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖連接在皂苷元的C-3、C-6和C-20位。人參皂苷根據(jù)皂苷元的不同可分為3類，包括原人參二醇型，如人參皂苷Rb1、Rc、Rd等；原人參三醇型，如人參皂苷Re、Rf、Rg1等；齊墩果酸型，如人參皂苷Ro等。原人參三醇型和原人參二醇型結(jié)構(gòu)的區(qū)別在于原人參三醇型的C-3位連接羥基，C-6位連接糖基取代基，而原人參二醇型的C-3位連接糖基取代基，C-6位無取代基。目前已從人參中分離鑒定出百余種人參皂苷，根據(jù)含量高低可以分為主要人參皂苷和稀有皂苷[8]。

主要人參皂苷在動物體內(nèi)通常代謝為稀有皂苷，稀有皂苷的生物活性通常高于主要人參皂苷[9]。如表1所示，稀有人參皂苷Rg3和C-K具有舒張血管、抗氧化、抗過敏、保護肝臟等活性[10-12]。稀有人參皂苷Rh2能夠抑制B16-BL6黑色素瘤細(xì)胞生長并刺激黑色素生成[13]。然而，人參中稀有皂苷的含量極低，很難通過提取分離的方法獲得。轉(zhuǎn)化主要人參皂苷是制備稀有皂苷的重要手段。

表1 稀有人參皂苷的藥理活性

如圖1所示，主要人參皂苷與稀有皂苷的結(jié)構(gòu)差異為皂苷元連接的糖基種類、數(shù)量以及烯烴支鏈的結(jié)構(gòu)不同?；谶@種結(jié)構(gòu)差異，建立了多種去除糖基取代基和改變烯烴鏈結(jié)構(gòu)的方法，將主要人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷，轉(zhuǎn)化途徑見圖2。人參皂苷轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是催化反應(yīng)，根據(jù)催化劑的種類，可以將人參皂苷轉(zhuǎn)化分為化學(xué)轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)化?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化通常以無機或有機酸、堿等作為催化劑，通過人參皂苷在酸、堿環(huán)境中發(fā)生去糖基化等反應(yīng)生成稀有皂苷。生物轉(zhuǎn)化通常利用糖苷酶和微生物等生物催化劑定向水解糖苷鍵，制備稀有皂苷。由于不同類型皂苷元的結(jié)構(gòu)差異，人參皂苷轉(zhuǎn)化的反應(yīng)物和產(chǎn)物都僅限于同一類型的皂苷，不同類型的人參皂苷不能互相轉(zhuǎn)化。本文從化學(xué)轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)化2個角度總結(jié)了目前人參皂苷轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域的代表性工作，探討了2種方法的優(yōu)點和局限性。

圖1 原人參二醇型(A)和原人參三醇型(B)型人參皂苷結(jié)構(gòu)

圖2 原人參二醇型(A)和原人參三醇型(B)型人參皂苷的轉(zhuǎn)化途徑

1 化學(xué)轉(zhuǎn)化

化學(xué)轉(zhuǎn)化是制備稀有皂苷的最初方法，Miyamoto等[23]報道了人參皂苷在酸性環(huán)境中的化學(xué)降解。目前，化學(xué)轉(zhuǎn)化主要有酸催化、堿催化和其他催化方法。

1.1 酸催化 常用的酸性催化劑包括鹽酸、酒石酸、甲酸、乙酸等。Bae等[24]以原人參二醇型皂苷為反應(yīng)物，利用0.1%或1%醋酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、鹽酸進行水解，最終轉(zhuǎn)化得到人參皂苷20(S)-Rg3。孫成鵬等[25]利用酒石酸水解原人參二醇型皂苷，得到20(R)-Rg3，最高轉(zhuǎn)化率為50.15%。Wu等[26]利用在50%甲醇水溶液中添加甲酸調(diào)節(jié)pH為2.0，加熱至60 ℃轉(zhuǎn)化原人參三醇型人參皂苷Re、20(S)-Rg2和20(S)-Rf。共轉(zhuǎn)化得到11種稀有皂苷。Teng等[27]以三七總皂苷為反應(yīng)物，利用乙酸-乙醇(1∶1)水解得到15種已知的和5種新的達(dá)瑪烷型皂苷。

除了傳統(tǒng)的酸性催化劑，近年來還出現(xiàn)了利用雜多酸及其復(fù)合物催化轉(zhuǎn)化人參皂苷的研究。雜多酸比傳統(tǒng)酸催化劑的質(zhì)子酸性更強，酸催化活性更高。Cao等[28]比較了硅鎢酸、硅鎢酸與環(huán)糊精復(fù)合物和甲酸等3種酸性催化劑對人參皂苷Rg1的催化轉(zhuǎn)化作用。結(jié)果表明，硅鎢酸能轉(zhuǎn)化Rg1獲得20(S)-Rh1和20(R)-Rh1，其轉(zhuǎn)化效率高于甲酸400倍。Xiu等[29]利用12-磷鎢酸轉(zhuǎn)化人參皂苷Re，并采用HPLC-MSn/HRMS技術(shù)鑒定了8種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化獲得了具有“3β，12β，25-三羥基-達(dá)瑪-20(21/22)-烯”皂苷元結(jié)構(gòu)的稀有皂苷25-OH-Rg6和25-OH-F4。在結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)上總結(jié)了人參皂苷化學(xué)轉(zhuǎn)化的主要途徑，包括去糖基化、差向異構(gòu)化、消除、水合等反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)碳正離子是影響各轉(zhuǎn)化途徑的主要因素。李雪等[30]進一步研究了雜多酸催化轉(zhuǎn)化原人參二醇型人參皂苷Rb1的產(chǎn)物與途徑。全部10種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑與文獻[29]結(jié)果相近。不同的是其還得到了2種環(huán)合反應(yīng)產(chǎn)物(20S,25)-環(huán)氧-Rg3和(20R,25)-環(huán)氧-Rg3。不同于傳統(tǒng)的均相酸催化反應(yīng)，雜多酸可從反應(yīng)體系中萃取分離，為人參皂苷的化學(xué)轉(zhuǎn)化提供了新的方法。

酸催化方法操作簡單，催化劑廉價易得，適合于工業(yè)生產(chǎn)，但是通常伴有多種副反應(yīng)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物較多，選擇性較差[31]。如何提高酸催化反應(yīng)的選擇性仍需要進一步研究。

1.2 堿催化 堿催化轉(zhuǎn)化人參皂苷的常用催化劑主要為氫氧化鈉、甲醇鈉等。Ma等[32]研究了氫氧化鈉水溶液水解人參莖葉總皂苷的產(chǎn)物，從中分離得到了12個已知化合物和2個新的達(dá)瑪烷型皂苷。李緒文等[33]使用氫氧化鈉和甘油轉(zhuǎn)化西洋參葉總皂苷，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為20(S)-Rh2。Cui等[34]研究發(fā)現(xiàn)，甲醇鈉的正丁醇溶液可水解絞股藍(lán)皂苷得到20(S)-原人參二醇。Im等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在吡啶等非質(zhì)子極性溶劑中加入甲醇鈉也可轉(zhuǎn)化人參皂苷得到原人參二醇和原人參三醇。

與酸催化相比，堿催化方法也具有操作簡便、催化劑廉價易得的特點，并且產(chǎn)物種類較少，轉(zhuǎn)化反應(yīng)選擇性較高。但堿催化對反應(yīng)溫度、pH要求較高，催化劑種類較少，并且轉(zhuǎn)化效率低于酸催化方法，研究報道相對較少。

1.3 其他催化法 Bai等[36]建立了一種利用微波輻射轉(zhuǎn)化主要人參皂苷獲得稀有皂苷Rg3、Rh2、20(S)-原人參二醇的方法。在中性、酸性、堿性溶液和N，N-二甲基甲酰胺中，西洋參葉總皂苷的轉(zhuǎn)化率最高為78.11%。微波促進了酸堿催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進行，即使在中性溶液和DMF中也可以有效轉(zhuǎn)化人參皂苷。

Jin等[37]研究了硫磺熏蒸人參對人參皂苷的影響，從硫熏人參中得到稀有皂苷Rh2和Rg5等。Li等[38]進一步研究了硫磺熏蒸轉(zhuǎn)化人參皂苷的途徑。主要人參皂苷通過加成、水解、脫水等反應(yīng)生成Rh2、Rg3等稀有皂苷。轉(zhuǎn)化方法的反應(yīng)條件和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總結(jié)見表2。

表2 人參皂苷化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件和產(chǎn)物

2 生物轉(zhuǎn)化

生物轉(zhuǎn)化可分為酶解法和微生物轉(zhuǎn)化法。與化學(xué)轉(zhuǎn)化對比，生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)特異性高、綠色環(huán)保等優(yōu)點，因此也成為制備稀有皂苷的主要方法。近年來，以原人參二醇型和原人參三醇型人參皂苷為底物的生物轉(zhuǎn)化研究取得了許多突破性進展。

2.1 酶解法 酶解法具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、產(chǎn)物單一等優(yōu)點，是轉(zhuǎn)化人參皂苷的重要途徑。不同種類的酶轉(zhuǎn)化人參皂苷的途徑不同。目前研究主要利用糖苷酶定向水解人參皂苷不同位置的糖苷鍵，從而獲得稀有人參皂苷[39]。Hou等[40]利用β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg3，通過水解C-3位末端的糖苷鍵獲得了稀有皂苷Rh2，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.7%。Pei等[41]利用β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1得到稀有皂苷20(S)-Rg3，轉(zhuǎn)化率達(dá)到97.8%。Zhang等[42]利用3種耐熱糖苷酶Tpebgl1、Tt-Afs、Tpebgl3協(xié)同轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1、Rb2、Rc為20(S)-Rg3，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到98.19%。協(xié)同轉(zhuǎn)化途徑為Tpebgl1和Tt-Afs轉(zhuǎn)化Rb1、Rb2、Rc為Rd，Tpebgl3轉(zhuǎn)化Rd為20(S)-Rg3[42]。Kim等[43]利用蜜環(huán)菌菌絲體中純化的糖苷酶BG-1轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb2為稀有皂苷C-Y和C-K，并闡明了轉(zhuǎn)化途徑為Rb2→C-O→C-Y→C-K。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過克隆和表達(dá)菌株基因得到的糖苷酶也被用于人參皂苷的轉(zhuǎn)化研究。Geraldi等[44]從芽孢桿菌3KP和粘質(zhì)沙雷氏菌LII61中克隆了β-糖苷酶、Bgl3KP、BglSM。這些酶能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b1經(jīng)過Rd和Gyp-XVII轉(zhuǎn)化為稀有皂苷F2。Wang等[45]克隆了枯草芽孢桿菌中的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，重組的糖基轉(zhuǎn)移酶將人參皂苷F1轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Ia。李男等[46]通過克隆、表達(dá)嗜熱菌基因組得到重組內(nèi)切纖維素酶 Fpendo5A。其能夠?qū)a1、Rb1、Rc、Rd、Rg3分別轉(zhuǎn)化為Rb2、Gyp XVII、CMC1、F2、Rh2。

可以看出，從菌株中分離或克隆表達(dá)的酶都能夠有效轉(zhuǎn)化人參皂苷獲得稀有皂苷，并具有選擇性高、特異性強的優(yōu)點。因此，酶的篩選也成為了人參皂苷酶解轉(zhuǎn)化方法的關(guān)鍵步驟。

2.2 微生物轉(zhuǎn)化法 微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷是利用微生物細(xì)胞代謝產(chǎn)生的酶水解糖苷鍵，從而獲得稀有皂苷。常用的微生物包括土壤微生物、腸道菌群、真菌、食品微生物等。這種轉(zhuǎn)化方法具有條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、操作簡便等優(yōu)點，是目前工業(yè)生產(chǎn)人參皂苷的常用方法[47]。

2.2.1 土壤微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷 土壤微生物指生活在土壤里的細(xì)菌、真菌和病毒等，其可促進土壤有機物質(zhì)的分解。Cheng等[48]從田間土壤中分離得到了能夠轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1和Rd為Rg3的微生物菌株GS514。Fu等[49]從種植人參土壤中分離到了53株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株，其中GS-09菌株可以將人參皂苷Rb1、Rb2、Rc定向轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-K。Su等[50]對從土壤中分離出的真菌F.proliferatumECU2042進行發(fā)酵，并利用從發(fā)酵液中分離的β-葡萄糖苷酶將人參皂苷Rg3轉(zhuǎn)化為20(S)-Rh2。Han等[51]從栽培的人參中獲得了絲狀真菌Fusariumsacchari，并首次報道了利用其高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc為稀有皂苷C-K、C-Mx、Mc的研究。吳秀麗等[52]從長白山生長人參的土壤中分離出各類菌株63株，其中黑曲霉Aspergillusniger的人參皂苷轉(zhuǎn)化活性最強，可以將人參皂苷Re轉(zhuǎn)化為Rg1、Rg2和Rh1。Wu等[53]從人參根際土壤中分離出的Aspergillustubingensis菌株能夠高效地將人參莖葉總皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Rh4及其苷元，其中苷元的含量比轉(zhuǎn)化前提高了100倍。

2.2.2 腸道菌群轉(zhuǎn)化人參皂苷 腸道菌群是人參皂苷體內(nèi)代謝和轉(zhuǎn)化制備稀有皂苷的研究熱點。Kim等[54]發(fā)現(xiàn)人類糞便微生物區(qū)系中分離的擬桿菌屬、雙歧桿菌屬和瘤胃球菌屬能將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-K。韓銘鑫等[55]在離體人腸道菌群中轉(zhuǎn)化原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc，獲得了Rd、F2、Rg3、CK、Rh2等參皂苷。Chen等[56]對人參皂苷Rb1的微生物代謝和哺乳動物代謝進行了比較研究。枝頂孢霉菌微生物轉(zhuǎn)化Rb1得到Rd、XVII、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、F2、C-K、12β-羥基-達(dá)瑪烷型-3-酮-20(S)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、25-羥基-(E)-20(22)-烯-人參皂苷Rg3等8種產(chǎn)物。在大鼠體內(nèi)除鑒定出相同的8種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物外還鑒定出2種不同的代謝產(chǎn)物。Bae等[57]發(fā)現(xiàn)20(S)-Rg3經(jīng)腸道菌群可代謝為20(S)-Rh2或20(S)-原人參二醇，而在人體胃部不能轉(zhuǎn)化為原人參二醇。

2.2.3 食品微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷 食品微生物包括生產(chǎn)型食品微生物和食源性病原微生物。Quan等[58]從韓國傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜中分離出的食品級乳酸桿菌LH4能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b1轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-K，摩爾轉(zhuǎn)化率為88%，轉(zhuǎn)化途徑為Rb1→Rd→絞股藍(lán)皂苷XVII→F2→C-K。Park等[59]從泡菜中獲得了5種細(xì)菌菌株，均能將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Rg3。夏晚霞等[60]選取了植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌等5種乳酸菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1和Re，分別得到了稀有皂苷C-K和Rh1。Chi等[61-62]研究了雙歧桿菌、黑曲霉、德氏乳桿菌、Bidobacteriumsp.SH5、活性乳酸菌等對人參皂苷Rb2和Rc的轉(zhuǎn)化作用，得到了人參皂苷F2、Rh2和Rd。

2.2.4 其他微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷 Zhou等[63]篩選得到了能夠替代腸道菌群轉(zhuǎn)化人參皂苷的真菌P.bainiersp.229，其能有效地將三七總皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-K，產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率是腸道菌群的2倍。Ye等[64]在含有三七葉皂苷的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中篩選出高耐底物Paecilomycesbainier229-7，并轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1得到了轉(zhuǎn)化率高達(dá)94.9%的人參皂苷Rd。除此之外，真菌AcremoniumstrictumAS 3.2058[65]、水解菌C.cellulanssp.21[66]、黑根霉Rhizopussp.[67]等多種微生物也都被用于原人參二醇型和原人參三醇型人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化研究。人參皂苷生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的條件和產(chǎn)物見表3。

表3 人參皂苷生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件和產(chǎn)物

3 結(jié)論及展望

綜上所述，化學(xué)轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)化均可以有效地轉(zhuǎn)化主要人參皂苷為稀有皂苷?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)化效率高，操作簡便，產(chǎn)物多樣，催化劑廉價易得等特點，但是反應(yīng)選擇性差，催化劑不易回收。生物轉(zhuǎn)化的特異性強、轉(zhuǎn)化率高、催化劑來源豐富，但是轉(zhuǎn)化途徑較為單一，不易得到改變皂苷元結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。2種轉(zhuǎn)化方法均有各自的優(yōu)點和局限性。隨著藥理作用的深入研究，越來越多的稀有人參皂苷將逐步從實驗室研究進入藥物研發(fā)和臨床試驗階段，對稀有皂苷的需求將逐漸增加。因此，建立簡單、高效、安全的轉(zhuǎn)化方法仍然是人參皂苷研究的重點?？梢灶A(yù)見的是，生物轉(zhuǎn)化仍將是轉(zhuǎn)化制備稀有皂苷的主要方法?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化憑借成熟的工業(yè)催化生產(chǎn)條件可能為制備稀有皂苷提供新的選擇。無論哪種方法，都將為基于稀有人參皂苷的相關(guān)研究提供充足的基礎(chǔ)原料。