一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定六味地黃丸中8種成分

李 艷， 侯媛芳， 伍永富， 談利紅， 穆禎強(qiáng)， 楊 林,4*

(1.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 401331；2.毒性中藥給藥系統(tǒng)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331；3.太極集團(tuán)重慶中藥二廠有限公司，重慶 402284；4.重慶市藥物制劑工程技術(shù)研究中心，重慶 401331)

六味地黃丸是滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典名方，由熟地黃、山茱萸(制)、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉6味藥材組成，具有滋陰補(bǔ)腎的功效，用于治療腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、遺精盜汗。但國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布公告(2021年第23號(hào))[1]，指出六味地黃制劑有腹瀉、腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、胃腸不適、食欲不振、便秘、瘙癢、皮疹、頭痛、心悸、過敏等不良反應(yīng)，要求藥品上市許可持有人應(yīng)當(dāng)對(duì)新增不良反應(yīng)發(fā)生機(jī)制開展深入研究。

2020年版《中國藥典》一部對(duì)六味地黃丸的含量控制指標(biāo)為莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚[2]，數(shù)量較少，難以全面準(zhǔn)確地反映其質(zhì)量；也有研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定六味地黃丸中多種有效成分含量[3-7]，但所需對(duì)照品數(shù)量多，耗費(fèi)大，檢測(cè)成本昂貴。目前，一測(cè)多評(píng)法已在中藥制劑的質(zhì)量控制中廣泛應(yīng)用[8-12]，但鮮有用于六味地黃制劑，而且定量指標(biāo)較少[13-14]。本實(shí)驗(yàn)綜合考慮成分有效性[15-20]、可測(cè)性、對(duì)照品易得性等方面，采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定六味地黃丸中沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚的含量，以期為該制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，也為研究其不良反應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，配置Waters 2998 PDA檢測(cè)器(美國Waters公司)；ME55電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；FA2204B電子天平(萬分之一，上海天美天平儀器有限公司)；800B多功能粉碎機(jī)(永康市速鋒工貿(mào)有限公司)；SB25-12DTN超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q integral-3超純水機(jī)(美國Merck Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸(批號(hào)110831-201605，純度90.8%)、5-羥甲基糠醛(批號(hào)111626-201912，純度99.2%)、莫諾苷(批號(hào)111998-201602，純度96.3%)、當(dāng)藥苷(批號(hào)111742-200501，純度100%)、馬錢苷(批號(hào)111640-201808，純度99.0%)、芍藥苷(批號(hào)110736-201943，純度95.1%)、丹皮酚(批號(hào)110708-201407，純度99.9%)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；山茱萸新苷對(duì)照品(批號(hào)19080905，純度98.0%)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。六味地黃丸(濃縮丸)共21批，購自太極集團(tuán)重慶中藥二廠有限公司，批號(hào)分別為1904086、1905103、1905109、1907154、1907155、1910224、2002033、2003039、2003040、2003041、2003042、2003043、2004062、2005069、2005071、2005075、2005076、2005078、2005079、2005080、2006086。甲醇、乙腈為色譜純，均購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；磷酸為色譜純，購自重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～8%A；5～20 min，8%A；20～35 min，8%～20%A；35～45 min，20%～60%A；45～55 min，60%A；55～56 min，60%～95%A；56～60 min，95%A；60～61 min，95%～5%A；61～66 min，5%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長240 nm；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖1。

1.沒食子酸 2.5-羥甲基糠醛 3.莫諾苷 4.當(dāng)藥苷 5.馬錢苷 6.芍藥苷 7.山茱萸新苷 8.丹皮酚1.gallic acid 2.5-hydroxymethyl-2-furaldehyde 3.morroniside 4.sweroside 5.loganin 6.paeoniflorin 7.cornuside 8.paeonol圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚對(duì)照品適量，70%甲醇溶解并稀釋成系列質(zhì)量濃度，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品適量，粉碎2 min，取粉末約1.65 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇約40 mL，超聲提取1 h，放冷，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液各20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，在200～400 nm波長處進(jìn)行全掃描，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖在對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)位置處有色譜峰，其光譜特征與對(duì)照品一致，峰純度檢測(cè)均符合要求(純度角度小于純度閾值)，分離度良好(均大于1.5)，理論塔板數(shù)均不低于3 000。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)

表1 各成分線性關(guān)系

樣測(cè)定，以丹皮酚為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7種成分的相對(duì)校正因子fk/s，公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚峰面積RSD分別為0.33%、0.30%、0.24%、0.25%、0.30%、0.32%、0.28%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品(批號(hào)1905109)，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚含量RSD分別為0.93%、0.65%、0.62%、0.61%、0.95%、0.78%、0.55%、0.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號(hào)1905109)，室溫下于0、4、8、12、18、24、36 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚峰面積RSD分別為0.44%、0.59%、0.34%、0.31%、0.22%、0.92%、0.49%、0.13%，表明溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品(批號(hào)1905109)粉末9份，每份約0.825 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，分成3組，每組3份，分別按80%、100%、120%水平精密加入對(duì)照品溶液(沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚質(zhì)量濃度分別為1.539、0.890、1.501、0.416、1.302、0.686、0.302、1.077 mg/mL)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚平均加樣回收率分別為102.2%、100.9%、101.6%、99.0%、101.9%、100.8%、100.0%、102.1%，RSD分別為0.51%、1.3%、0.93%、1.2%、1.5%、1.7%、0.67%、0.82%。

2.11 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，考察Waters e2695、Agilent 1260 InfinityⅡ、Shimadzu Nexera X2色譜儀及Phenomenex Luna C18、Waters Sunfire C18、Wondasil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響(RSD<5%)。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.12 色譜峰定位 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以丹皮酚色譜峰為參照，計(jì)算其他7種成分相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見表4，可知它們?cè)诓煌瑑x器、色譜柱下穩(wěn)定性良好(RSD<5%)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行色譜峰定位。

表4 各成分相對(duì)保留時(shí)間

2.13 樣品含量測(cè)定 取21批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，再采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表5，可知2種方法所得結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 色譜條件選擇 流動(dòng)相采用乙腈-0.2%磷酸并進(jìn)行梯度洗脫，相對(duì)于2020年版《中國藥典》中的乙腈-0.3%磷酸，降低了酸性，更有利于延長色譜柱使用壽命。再采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)各成分在240 nm波長處均有較大吸收，為了兼顧響應(yīng)值，選擇該處作為檢測(cè)波長。

3.2 內(nèi)標(biāo)選擇 選擇內(nèi)標(biāo)時(shí)，應(yīng)遵循性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)廉、易得、低毒、有效的原則。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚含量高，性質(zhì)穩(wěn)定，無毒，對(duì)照品廉價(jià)并易得，色譜峰峰形最優(yōu)，故選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

3.3 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，50%甲醇、70%甲醇、甲醇加熱回流提取1 h時(shí)，70%甲醇提取效率最高，但低于超聲提取相同時(shí)間；3種溶劑超聲提取1 h時(shí)，甲醇超聲提取效率最低，而且莫諾苷、馬錢苷峰形差，出現(xiàn)拖尾、前沿分裂現(xiàn)象，無法滿足分析要求，其原因是甲醇與初始比例流動(dòng)相(5%乙腈)極性相差過大而引起的溶劑效應(yīng)，雖然50%、70%甲醇提取效率無顯著差異，但50%甲醇提取1 h后微孔濾膜過濾溶液困難，可操作性差。最終，選擇70%甲醇超聲提取1 h作為供試品溶液制備方法。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/丸，n=2)

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定丹皮酚、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、當(dāng)藥苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷的含量，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，所得結(jié)果與外標(biāo)法接近，可為該制劑全面科學(xué)的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。