蘋(píng)小吉丁自然種群腸道微生物多樣性*

賈斐然 周忠福 趙文霞 孫薈荃 姚艷霞

(國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所 北京 100091)

新疆野蘋(píng)果(Malussieversii)也稱塞威氏蘋(píng)果，是第三紀(jì)孑遺植物，為現(xiàn)代栽培蘋(píng)果的祖先(林培鈞等， 2000)； 在我國(guó)境內(nèi)主要分布于新疆鞏留至新源的南部低山，霍城至伊寧的北部低山； 這些地區(qū)主要為1 200～1 600 m的陰坡、半陰坡以及河谷地帶，并與哈薩克斯坦中亞山地野蘋(píng)果林相連(李利平等， 2011)。然而，近年來(lái)，蘋(píng)小吉丁(Agrilusmali)(鞘翅目Coleoptera： 吉丁甲科Buprestidae)在新疆野蘋(píng)果林內(nèi)暴發(fā)成災(zāi)，導(dǎo)致新疆野蘋(píng)果損失慘重； 蘋(píng)小吉丁主要以幼蟲(chóng)蛀食蘋(píng)果等薔薇科果樹(shù)的韌皮部、造成寄主枝條干枯，嚴(yán)重時(shí)使整株植物死亡(Bozorovetal.， 2019； 崔志軍等， 2018； 王智勇， 2013； 周忠福等， 2020)。

為揭示蘋(píng)小吉丁成災(zāi)機(jī)制，探討其在危害過(guò)程中腸道微生物可能產(chǎn)生的作用，本研究擬對(duì)蘋(píng)小吉丁腸道真菌和細(xì)菌多樣性開(kāi)展研究。眾所周知，昆蟲(chóng)體內(nèi)棲息著大量的微生物，這些微生物主要以腸道菌群(gut microbiota)的形式定殖在消化道內(nèi)(Dongetal., 2009)，與宿主昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成了相互依存的共生關(guān)系，參與了昆蟲(chóng)絕大多數(shù)的生命活動(dòng)，對(duì)宿主的生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要作用(王四寶等， 2017)，因此，在研究害蟲(chóng)危害時(shí)，不僅要著眼于昆蟲(chóng)本身，還要關(guān)注與之密切相關(guān)的腸道菌群。昆蟲(chóng)腸道獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)為多種多樣的微生物定殖提供了特殊環(huán)境，腸道菌群組成與宿主昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、繁殖、防御等生命活動(dòng)密切相關(guān)(Brummeletal.， 2004； Hosokawaetal.， 2010； Kikuchietal., 2007)； 這種相對(duì)穩(wěn)定的關(guān)系對(duì)昆蟲(chóng)整個(gè)生命周期具有極其重要的作用(張靜等， 2017)： 一方面，腸道為菌群提供穩(wěn)定的生存環(huán)境和必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Pangetal.， 2016； Petersonetal., 2016)，昆蟲(chóng)腸道微環(huán)境可以影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝活動(dòng)，從而賦予腸道菌群種類多樣性和宿主特異性的特點(diǎn)(Kuraishietal.,2013)； 另一方面，昆蟲(chóng)腸道菌群參與調(diào)控宿主生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝和環(huán)境適應(yīng)性等諸多生物學(xué)過(guò)程，是調(diào)控宿主生物學(xué)性狀的重要調(diào)節(jié)因子(Douglas， 2015； Hammeretal., 2015)。

我國(guó)學(xué)者已初步開(kāi)展了蘋(píng)小吉丁腸道微生物群落多樣性研究(Zhangetal.， 2018； Bozorovetal.， 2019)，奠定了良好的基礎(chǔ)，然而，就目前的數(shù)據(jù)來(lái)看，蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌群落較為復(fù)雜且多變，并未呈現(xiàn)較為一致的研究結(jié)果，而真菌群落研究較少。為此，本研究在前人的基礎(chǔ)上，通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)真菌ITS基因和細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行分析，對(duì)我國(guó)新疆伊犁地區(qū)不同蟲(chóng)期(幼蟲(chóng)和成蟲(chóng))、不同環(huán)境條件(栽培果園和野果林)的蘋(píng)小吉丁自然種群腸道微生物群落多樣性進(jìn)行研究，并運(yùn)用PICRUSt2 軟件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，以期為下一步探討蘋(píng)小吉丁腸道菌群功能提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣地

新疆伊犁自治州鞏留縣受蘋(píng)小吉丁危害較為嚴(yán)重，因此本研究選擇在受害最為嚴(yán)重的新疆野果林和人工栽培蘋(píng)果(M.pumila)園內(nèi)設(shè)置樣地，每個(gè)樣地大小為100 m×100 m。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)取樣方法 在蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)出蟄危害季節(jié)于樣地中隨機(jī)選取30枝帶蟲(chóng)枝條作為試驗(yàn)樣品(表1)。將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后在無(wú)菌條件下解剖枝條，剝?nèi)∮紫x(chóng)放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 蘋(píng)小吉丁成蟲(chóng)的取樣方法 在成蟲(chóng)羽化高峰期使用捕蟲(chóng)網(wǎng)，在樣地內(nèi)捕捉成蟲(chóng)，將樣地內(nèi)的成蟲(chóng)分別放入貼有標(biāo)簽的收集管中，再放入有冰袋的冰盒內(nèi)立即帶回實(shí)驗(yàn)室，隨后將成蟲(chóng)放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 腸道獲取 將保存于-80 ℃冰箱的蘋(píng)小吉丁取出，隨后用75%的酒精對(duì)蟲(chóng)體表面消毒3次，每次1 min，再用無(wú)菌水清洗3遍。將體式解剖鏡置于超凈工作臺(tái)中，與超凈工作臺(tái)一起紫外滅菌20 min，用已滅菌的鑷子和解剖針在PBS緩沖液中解剖蟲(chóng)體，分離出腸道，將腸道置于已滅菌的2 mL離心管中，如表1編號(hào)。

表1 蘋(píng)小吉丁樣品信息①Tab.1 Sample information of Agrilus mali

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，Hilden，德國(guó))試劑盒、參照說(shuō)明書(shū)提取蘋(píng)小吉丁腸道總DNA。以該總DNA為模板，分別以通用引物對(duì)333F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCAG-3′； 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和FITS7/RITS4(5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′； 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增真菌ITS2區(qū)域(Blaalidetal.， 2013)和細(xì)菌16S rRNA V3+V4 區(qū)域(張軍毅等， 2015)。PCR擴(kuò)增體系總體積均為50 μL： DNA模板2 μL，TransStartTaq DNA Polymerase 0.5 μL，10×Buffer 5 μL，引物338F/806R(10 mmol·L-1)各1 μL，dNTPs(各2.5 mmol·L-1)4 μL，ddH2O 36.5 μL。PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)3次，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物合并后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨后采用Illumina MiSeqPE300測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

MiSeq測(cè)序完成后，對(duì)獲得的原始序列(raw reads)進(jìn)行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列(50個(gè)連續(xù)堿基平均質(zhì)量<25，序列長(zhǎng)度<50bp，模糊堿基≥1)。運(yùn)用Flash V1.0.3軟件將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，去除嵌合體，剔除宿主自身、葉綠體和線粒體序列后，獲得優(yōu)質(zhì)序列(clean reads)數(shù)據(jù)。用軟件QIIME對(duì)優(yōu)質(zhì)序列在97%水平上進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類，并利用Silva和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)1.3節(jié)擴(kuò)增獲得的蘋(píng)小吉丁腸道真菌ITS和細(xì)菌16S rRNA序列進(jìn)行物種注釋。基于OTU的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，利用Mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，用于反映樣本內(nèi)菌群的多樣性。本研究選取Shannon、Simpson、Ace、Chao、coverage 5 個(gè)常用指數(shù)來(lái)分析蘋(píng)小吉丁腸道菌群的多樣性。Chao和Ace指數(shù)反映樣品中群落豐富度，二者數(shù)值越大，表示樣品中群落豐富度越高； Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣品中物種多樣性，Shannon指數(shù)越高，Simpson指數(shù)越小，說(shuō)明樣品中的物種多樣性越高； coverage常用在微生物16S/18S/ITS測(cè)序中，作為反映測(cè)序深度的指標(biāo)。其值越接近于1，說(shuō)明測(cè)序深度越合理，測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。

1.5 PICRUSt2功能預(yù)測(cè)

利用PICRUSt2軟件進(jìn)行ITS和16S rRNA基因數(shù)據(jù)功能預(yù)測(cè)，將測(cè)序樣品中的基因數(shù)據(jù)通過(guò)EC基因家族到途徑的結(jié)構(gòu)化映射，在PICRUSt2中計(jì)算出COG、KO的豐度信息和MetaCyc途徑的豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接組裝與OTU聚類分析

蘋(píng)小吉丁成蟲(chóng)腸道真菌ITS2與細(xì)菌16S rRNA高通量測(cè)序質(zhì)控拼接后共獲得OTU分別為285和1 470個(gè)(表2)。從不同蟲(chóng)態(tài)來(lái)看： 蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)腸道真菌和細(xì)菌OTU數(shù)均大于成蟲(chóng)腸道； 從不同寄主來(lái)看： 新疆野蘋(píng)果蘋(píng)小吉丁腸道真菌OTU數(shù)大于栽培蘋(píng)果蘋(píng)小吉丁腸道，而細(xì)菌則相反。

表2 不同寄主不同蟲(chóng)態(tài)蘋(píng)小吉丁腸道真菌ITS2和細(xì)菌16S rRNA高通量測(cè)序基本信息Tab.2 Basic information of high-throughput sequencing of fungal ITS2 and bacterial 16S rRNA in gut of A. mali with different hosts and stages

2.2 蘋(píng)小吉丁腸道真菌和細(xì)菌鑒定

通過(guò)序列比對(duì)，共鑒定真菌5門(mén)22綱50目92科和122屬，細(xì)菌40門(mén)103綱231目364科和594屬。其中真菌主要隸屬于3門(mén),即擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycete)、子囊菌門(mén)(Ascomycota)、被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)，12綱，即座囊菌綱(Dothideomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、囊擔(dān)子菌綱(Cystobasidiomycetes)、酵母綱(Saccharomycetes)、子囊菌綱(Ascomycota)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、圓盤(pán)菌綱(Orbiliomycetes)、擔(dān)子菌綱(Basidiomycota)、傘形束梗孢菌綱(Agaricostibomycetes)； 細(xì)菌主要隸屬于7門(mén)，即變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、Bacteroidota、Patescibacteria、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、疣微菌綱(Verrucomicrobiota)，11綱，即γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、α-變形菌(Alphaproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、纖細(xì)菌綱(Gracilibacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、儉菌總門(mén)未確定綱(Parcubacteria)、疣微菌綱(Verrucomicrobiae)； 其中，γ-變形菌綱、放線菌綱、α-變形菌綱、芽孢桿菌綱、座囊菌綱、糞殼菌綱、銀耳綱在每個(gè)樣品中均有分布(圖1)。

圖1 蘋(píng)小吉丁腸道真菌和細(xì)菌組成(綱級(jí)分類階元)Fig. 1 Gut microbiota composition of Agrilus mali (at the class level)

2.3 腸道細(xì)菌和真菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析結(jié)果表明(表3)，測(cè)序深度基本覆蓋到樣品中所有的物種，已獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)量足以覆蓋蘋(píng)小吉丁腸道大多數(shù)微生物類群； 野果林蘋(píng)小吉丁腸道真菌群落豐富度和物種多樣性成蟲(chóng)均大于幼蟲(chóng)，而細(xì)菌群落豐富度成蟲(chóng)小于幼蟲(chóng)，但物種多樣性成蟲(chóng)卻大于幼蟲(chóng)，說(shuō)明在蘋(píng)小吉丁不同的發(fā)育階段，腸道微生物群落變化較大，此外，蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)腸道微生物群落和物種多樣性在栽培果園遠(yuǎn)大于野果林。

2.4 不同蟲(chóng)態(tài)、不同環(huán)境蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌和真菌的差異性

從屬級(jí)分類階元來(lái)看，不同蟲(chóng)態(tài)、不同環(huán)境蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌和真菌組成存在差異，其中CA特有真菌11屬，特有細(xì)菌2屬； CL特有真菌28屬，特有細(xì)菌223屬； WA特有真菌37屬，特有細(xì)菌47屬； WL特有真菌12屬，特有細(xì)菌68屬。而在4組樣品的核心菌群中，真菌7屬，細(xì)菌21屬(圖2)，其中共有真菌為枝孢菌屬(Cladosporium)、Cutaneotrichosporon、籃狀菌屬(Talaromyces)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、假絲酵母屬(Candida)、頂孢霉菌屬(Acremonium)；可供比對(duì)的 共有細(xì)菌為腸桿菌屬(Enterobacter)、隆布次氏菌屬(Romboutsia)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、副球菌屬(Paracoccus)、拉爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、諾卡氏菌屬(Nocardioides)、微桿菌屬(Microbacterium)、鼠李桿菌屬(Rathayibacter)、曲棍桿菌屬(Curtobacterium)、漆螺科未確定屬(Lachnospiraceae)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、擬黑桿菌屬(Paeniglutamicibacter)、擬桿菌屬(Planomicrobium)、泛菌屬(Pantoea)、需氧菌屬(Aeromicrobium)。

表3 不同寄主不同蟲(chóng)態(tài)蘋(píng)小吉丁腸道內(nèi)真菌和細(xì)菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.3 Diversity indices of fungi and bacteria in gut of A. mali at different hosts and stages

圖2 腸道真菌和細(xì)菌維恩圖Fig. 2 Venn diagram of gut fungi and bacteria

2.5 PICRUSt2功能預(yù)測(cè)

通過(guò)COG功能預(yù)測(cè)獲得蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌總共擁有23個(gè)功能(圖3)，并且野果林蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌擁有的功能總體比栽培果園蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌的高(表4)； 通過(guò)MetaCyc代謝途徑分析，共注釋到74條真菌代謝通路，426條細(xì)菌代謝通路，并且各樣品之間代謝通路Top20豐度存在一定差異(圖4、5)，其中，栽培蘋(píng)果蘋(píng)小吉丁腸道真菌代謝通路數(shù)量遠(yuǎn)大于野蘋(píng)果蘋(píng)小吉丁腸道真菌代謝通路數(shù)量，且成蟲(chóng)腸道真菌代謝通路數(shù)量大于幼蟲(chóng)腸道真菌代謝通路數(shù)量，這可能與寄主和環(huán)境有關(guān)； 通過(guò)KEGG代謝途徑分析，共注釋到871條真菌代謝通路，426條細(xì)菌代謝通路。同時(shí)，酶功能熱圖(Enzyme Heatmap)顯示各樣品之間酶的豐度存在較大差異(圖6)，并且成蟲(chóng)腸道真菌酶的豐度明顯多于幼蟲(chóng)，而細(xì)菌則相反，成蟲(chóng)酶的豐度小于幼蟲(chóng)，說(shuō)明蘋(píng)小吉丁腸道真菌對(duì)成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，而腸道細(xì)菌則對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵性作用。

圖3 腸道細(xì)菌COG功能基因預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of COG functional gene in gut bacteria

表4 不同寄主不同蟲(chóng)態(tài)蘋(píng)小吉丁腸道內(nèi)COG預(yù)測(cè)功能類別占比Tab.4 The proportion of COG prediction function categories in gut of A. mali with different hosts and stages

續(xù)表 Continued

圖4 腸道真菌MetaCyc代謝途徑Top 20豐度統(tǒng)計(jì)Fig. 4 Top 20 MetaCyc pathway of abundance for the gut fungus

圖5 腸道細(xì)菌MetaCyc代謝途徑Top 20豐度統(tǒng)計(jì)Fig. 5 Abundance statistics of gut bacteria MetaCyc pathway Top 20

3 討論

3.1 序列拼接組裝與OTU聚類分析

從獲得的OTU數(shù)量來(lái)看，蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌CA遠(yuǎn)小于其他3個(gè)組(CL、WA和WL)，推測(cè)可能的原因是： 取樣時(shí)CL、WA、WL來(lái)自新鮮蟲(chóng)體，而CA蟲(chóng)體曾保存在液氮中3個(gè)月，CA腸道部分細(xì)菌已降解； 但是真菌CA與其他組差異不大，說(shuō)明真菌并未受樣品的影響。此外，蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)腸道真菌和細(xì)菌OTU數(shù)量均大于成蟲(chóng)，這可能是由于昆蟲(chóng)腸道結(jié)構(gòu)不同所導(dǎo)致，也可能與取食寄主植物成份有關(guān)，蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)取食韌皮部，而成蟲(chóng)取食葉片，不同的飲食導(dǎo)致腸道產(chǎn)生不同的生化反應(yīng)從而形成出不同的微生物群落，類似的結(jié)果在大頭金蠅(Chrysomyamegacephala)和蜣螂(Coprisincertus)中有過(guò)報(bào)道(Wangetal.， 2018； Surez-Mooetal.， 2020)，并且，已證實(shí)食木昆蟲(chóng)腸道細(xì)菌豐富(Engeletal.， 2013)，因此，細(xì)菌為蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)腸道微生物的優(yōu)勢(shì)種。同時(shí)，昆蟲(chóng)腸道細(xì)菌與真菌之間具有復(fù)雜的相互作用(Zhangetal.， 2018)，細(xì)菌可以促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)(Briardetal.， 2016)，待成蟲(chóng)羽化后，其食物發(fā)生了改變，細(xì)菌不再是優(yōu)勢(shì)菌群，真菌也出現(xiàn)了相應(yīng)的變化。再者，造成野蘋(píng)果和栽培蘋(píng)果蘋(píng)小吉丁腸道菌群OTU數(shù)量上的差異，可能與寄主有關(guān)，也可能與人為干擾有關(guān)，野果林有放牧活動(dòng)，而栽培果園林下種植苜蓿(Medicago)，定期割除，對(duì)此，還需更多的數(shù)據(jù)支持方可進(jìn)一步探討。

3.2 蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌和真菌鑒定及多樣性研究

在腸道核心真菌類群中，本研究與Zhang 等(2018)所報(bào)道的曲霉菌屬、枝孢菌屬、假絲酵母屬、青霉菌屬所相同，其中念珠菌屬、曲霉菌屬及青霉菌都為常見(jiàn)的致病菌，本研究測(cè)得的頂孢霉菌屬、Cutaneotrichosporon和曲霉菌屬為核心真菌類群未見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)本研究核心菌群不包括Zhang等報(bào)道的隱球菌屬、莖點(diǎn)霉屬、鐮刀菌屬和節(jié)擔(dān)菌屬真菌，莖點(diǎn)霉屬和鐮刀菌屬的很多種類是植物致病菌(楊文等， 2016； Chengetal.， 2019)，并且鐮刀菌屬是蘋(píng)小吉丁伴生菌的主要類群(周忠福等， 2020)。腸道微生物群落的不同可能是由于捕捉蘋(píng)小吉丁的地點(diǎn)不同，其寄主品種出現(xiàn)了差異所致(Colmanetal.， 2012)。本研究結(jié)果腸道細(xì)菌中有3門(mén)4綱，與Bozorov等(2019)研究結(jié)果一致，即變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和γ-變形菌綱、放線菌綱、梭菌綱、芽孢桿菌綱，并且在細(xì)菌Top 20屬都存在泛菌屬和假單胞菌屬，泛菌屬對(duì)蘋(píng)小吉丁纖維素分解具有重要作用(Bozorovetal.， 2019)，該菌也是本研究中4個(gè)樣品的共有菌群，而Zhang 等(2018)在研究蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌時(shí)未報(bào)道存在該細(xì)菌，說(shuō)明在一定的條件下，泛菌屬細(xì)菌可能對(duì)蘋(píng)小吉丁纖維素分解起到一定作用，但是否與蘋(píng)小吉丁形成共生關(guān)系需進(jìn)一步研究； 而假單胞菌屬細(xì)菌由于其具有能固定穿入組織、產(chǎn)生彈力應(yīng)蛋白和具有粘連活性等特性，常被作為潛在的致病菌(錢(qián)伯欽，1986)，可引起植物立枯病的勞爾氏菌屬(Ralstonia)(林海云等， 2011)和引起的植物病害發(fā)生率位居十大細(xì)菌性植物病害之首的假單胞菌屬(王丹丹等， 2017)同樣也在蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌Top 20中存在。 總體而言，蘋(píng)小吉丁腸道中細(xì)菌和真菌都有較多的植物致病菌，但蘋(píng)小吉丁與致病菌是否存在協(xié)同作用共同危害寄主植物也需進(jìn)一步研究。

此外，本研究在蘋(píng)小吉丁成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)腸道中均發(fā)現(xiàn)大量厚壁菌門(mén)細(xì)菌，其在宿主的物質(zhì)和能量代謝過(guò)程中起著非常重要的作用，并且其對(duì)食物的消化起著重要作用(Hongetal.， 2011； Ruthetal.， 2008)。蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)以蘋(píng)果枝條韌皮部為食，其中含有大量的纖維素和半纖維素組分，食物中纖維素和半纖維素在蘋(píng)小吉丁腸道內(nèi)首先被這些厚壁菌門(mén)的細(xì)菌所分解，分解產(chǎn)物進(jìn)而被其他細(xì)菌利用，如梭菌綱細(xì)菌和擬桿菌綱細(xì)菌在丁酸的生成中起著非常重要的作用(Zhuetal.， 2011)，因此推測(cè)這些細(xì)菌都參與了蘋(píng)小吉丁腸道內(nèi)食物的消化過(guò)程。同時(shí)，筆者在蘋(píng)小吉丁腸道中的共有菌群檢測(cè)到了乳桿菌屬細(xì)菌，該屬細(xì)菌還具有合成碳水化合物降解酶(糖苷水解酶、果膠降解酶、多糖水解酶)的能力，由此推測(cè)其與蘋(píng)小吉丁的營(yíng)養(yǎng)代謝有關(guān)(張?bào)薜龋?2009)，也曾有報(bào)道該屬對(duì)腸黏膜具有很強(qiáng)的黏附能力，具有拮抗有害菌定植、減少腸道疾病發(fā)生和改善腸道菌群分布的能力； 并且能產(chǎn)生廣譜抗菌物質(zhì)，廣泛且有效的抑制細(xì)菌、酵母、真菌和病原蟲(chóng)等的生長(zhǎng)，對(duì)昆蟲(chóng)提高免疫力方面發(fā)揮著重要的作用(Olofssonetal.， 2008； Pangetal., 2011)。另外，目前也有報(bào)道稱乳桿菌屬細(xì)菌對(duì)昆蟲(chóng)抗藥性具有一定作用，并且蘋(píng)小吉丁腸道的共有菌群中還發(fā)現(xiàn)了伯克霍爾德菌屬細(xì)菌，可能參與有毒物質(zhì)解毒過(guò)程的細(xì)菌(Xiaetal.， 2013)，但這些腸道菌與蘋(píng)小吉丁是否具備抗藥性以及與其抗藥性的產(chǎn)生是否相關(guān)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 不同蟲(chóng)態(tài)不同環(huán)境的蘋(píng)小吉丁腸道微生物的差異性

本研究4組不同樣本中均存在枝孢菌屬、籃狀菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬等7屬真菌和腸桿菌屬、乳酸桿菌屬、伯克霍爾德菌屬等21屬細(xì)菌，這些真菌和細(xì)菌可能與蘋(píng)小吉丁建立了某種共生關(guān)系，對(duì)蘋(píng)小吉丁具有非常重要的生理功能，這些功能有待進(jìn)一步深入研究。

昆蟲(chóng)從幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，消化道的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)出現(xiàn)了較大的差異，對(duì)于食物的攝取表現(xiàn)出較大的不同。盡管昆蟲(chóng)達(dá)到成蟲(chóng)階段前的多次蛻皮過(guò)程中，前腸或后腸壁會(huì)逐漸形成適于細(xì)菌定殖的表面結(jié)構(gòu)，有些腸道微生物可以保留下來(lái)，然而，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)仍然受到了影響(曹樂(lè)等， 2018)。本研究從Alpha多樣性分析結(jié)果來(lái)看，野果林蘋(píng)小吉丁腸道真菌群落豐富度和物種多樣性成蟲(chóng)大于幼蟲(chóng)，說(shuō)明成蟲(chóng)腸道真菌種類多而且均勻度好，和Zhang等(2018)的研究結(jié)果一致； 對(duì)于野果林蘋(píng)小吉丁腸道細(xì)菌群落而言，豐富度成蟲(chóng)小于幼蟲(chóng)，但物種多樣性成蟲(chóng)卻大于幼蟲(chóng)，說(shuō)明細(xì)菌在幼蟲(chóng)腸道中種類較多，但是各個(gè)種類的數(shù)量分布并不均勻，存在明顯的優(yōu)勢(shì)類群，這在許多昆蟲(chóng)腸道微生物研究中得到證實(shí)(Tsuchida， 2002； 黃勝威， 2012； Engeletal.， 2013； Zhangetal， 2018； 王爭(zhēng)艷等， 2020)。

此外，蘋(píng)小吉丁幼蟲(chóng)腸道真菌和細(xì)菌群落豐富度和物種多樣性在栽培果園大于野果林，這應(yīng)該與寄主存在密切關(guān)系，蘋(píng)小吉丁在栽培果園取食蘋(píng)果樹(shù)，而在野果林取食新疆野蘋(píng)果樹(shù)。Zhang等(2018)曾發(fā)現(xiàn)喂食蘋(píng)果葉片會(huì)使蘋(píng)小吉丁成蟲(chóng)腸道微生物Alpha多樣性升高?？梢?jiàn)，即使同屬不同種之間的寄主差異也可以引起昆蟲(chóng)腸道微生物群落發(fā)生變化。

3.4 PICRUSt2功能預(yù)測(cè)

PICRUSt2分析通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，將微生物的多樣性情況與功能聯(lián)系起來(lái)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在不同樣品中腸道微生物種類和豐度雖有較大的差別，但其功能大致相同，所以推測(cè)在蘋(píng)小吉丁腸道中發(fā)揮功能的為一固定類群，可能是其與宿主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。從圖6可以看出，細(xì)菌注釋到Enzyme功能幼蟲(chóng)腸道中的豐度明顯多于成蟲(chóng)，而真菌注釋到Enzyme功能成蟲(chóng)腸道中的豐度明顯多于幼蟲(chóng)，推測(cè)其與不同發(fā)育階段固有的飲食特殊化和個(gè)體發(fā)育特征有關(guān)(Shuklaetal.， 2016)。細(xì)菌群落中纖維素分解細(xì)菌包括假單胞菌屬都在以蘋(píng)果樹(shù)的形成層和韌皮部為食的幼蟲(chóng)腸道中更為豐富，并且在取食不同食物葉片的成蟲(chóng)之間的細(xì)菌群落相似(Zhangetal.， 2018)，因此其功能未發(fā)生大的改變，只是有所降低； 相比之下，真菌群落更容易受到不同食物的影響，許多昆蟲(chóng)腸道真菌都來(lái)自于周圍環(huán)境，包括食物的葉子表面(Zhangetal.， 2018)，所以成蟲(chóng)取食葉片后，腸道中真菌數(shù)量增加，從而的整體功能呈現(xiàn)增加的變化。

4 結(jié)論

不同蟲(chóng)態(tài)、不同環(huán)境蘋(píng)小吉丁腸道真菌和細(xì)菌種類和豐度存在差異，腸道真菌種類和豐度成蟲(chóng)大于幼蟲(chóng)，而細(xì)菌幼蟲(chóng)大于成蟲(chóng)，說(shuō)明真菌對(duì)于成蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵性作用，而細(xì)菌對(duì)于幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵性作用。此外，不同的腸道微生物結(jié)構(gòu)與組成，呈現(xiàn)出大致相同的功能，因此推測(cè)在蘋(píng)小吉丁腸道中發(fā)揮功能的為一些固定類群，這可能是與其宿主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。