油茶根系與內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌互作早期的轉(zhuǎn)錄組分析*

李梓楊 陳曉琳 李麗麗 許詩萍 何苑皞

(1.南方人工林病蟲害防治國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)濟(jì)類培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長沙 410004)

內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于健康植物體內(nèi)，具有促進(jìn)植物生長、提高作物產(chǎn)量、提高植物存活率、抑制病原菌生長、修復(fù)環(huán)境污染、溶解磷酸鹽、促進(jìn)氮吸收等作用(Bulgarellietal., 2012),通過長期的進(jìn)化與寄主植物形成了互利互惠和的關(guān)系。內(nèi)生細(xì)菌在互作早期，利用自身的趨化性、運(yùn)動性、黏附作用以及分泌一些小分子物質(zhì)與植物建立互作關(guān)系實(shí)現(xiàn)定殖并發(fā)揮作用；植物通過激素應(yīng)答、免疫反應(yīng)啟動、次生代謝物合成、碳代謝等一系列的變化來響應(yīng)內(nèi)生細(xì)菌的定殖。植物根系或根系分泌物接觸后內(nèi)生菌轉(zhuǎn)錄組變化明顯，其中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、抗壓、IV型菌毛、粘附、植物來源化合物的利用等相關(guān)基因的表達(dá)變化顯著(Shidoreetal., 2014; Yietal., 2014; Pankieviczetal., 2014; Sheibani-Tezerjietal., 2015)。植物根系在接觸內(nèi)生菌后，受體激酶、植物激素信號通路、木質(zhì)素積累、細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)變化明顯(Drogueetal., 2014; Irizarry, 2018; Galambosetal., 2020)。目前研究主要以互作后期為主，而互作早期的研究較少，而互作早期植物各項(xiàng)生理變化較為顯著，是互作的關(guān)鍵時(shí)間，以互作早期的植物根系為研究對象。目前，內(nèi)生細(xì)菌與植物互作研究主要集中在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、棉花(Anemonevitifolia)等模式生物上，對于木本植物則關(guān)注較少，而內(nèi)生細(xì)菌與油茶(Camelliaolefolia)互作的研究還未見報(bào)道。

筆者課題組前期從油茶內(nèi)分離出1株內(nèi)生細(xì)菌——枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis1-L-29gfpr)，該菌株可成功在油茶根系內(nèi)定殖，并具有促進(jìn)生長、抗病作用(Xuetal., 2020)。在本研究將該菌株接種油茶根系構(gòu)建油茶-內(nèi)生細(xì)菌活體互作體系，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究不同時(shí)間(0、6、12、24 h)油茶根系轉(zhuǎn)錄組的變化，旨在解析油茶根系響應(yīng)內(nèi)生細(xì)菌侵染的變化規(guī)律，為后期深入研究內(nèi)生細(xì)菌與油茶的互作機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將油茶種子表面消毒后，放入無菌組培瓶中，17 ℃保濕培養(yǎng)，直至幼莖5 cm左右。內(nèi)生細(xì)菌B.subtilis1-L-29gfpr為中南林業(yè)科技大學(xué)微生物菌種保藏室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油茶接種內(nèi)生菌 將培養(yǎng)18 h的內(nèi)生細(xì)菌1-L-29gfpr離心后重懸于PBS緩沖液中，濃度調(diào)至1×108cfu·mL-1，用注射器吸取20 mL緩沖液注射到組培瓶中，將油茶根系浸泡于緩沖液中， 20 min后將根系取出以無菌水沖洗3遍后置于無菌組培瓶中繼續(xù)保濕培養(yǎng)。分別于0 h(不接種對照)、接種后6 h(6 hpi)、12 h(12 hpi)、24 h(24 hpi)截取油茶根系根尖部位。取樣后將樣品液氮速凍，于-80 ℃保存。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 RNA提取、文庫構(gòu)建及測序 采用TRIZOL試劑盒(Invitrogen，美國) 分別提取0 、6 、12 、24 h共 12 個(gè)樣品的總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取。利用 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent，美國)檢測RNA質(zhì)量，用帶有 Oligo(dT) 的磁珠富集真核生物Mrna； 使用緩沖液將富集的mRNA片段化為短片段，并使用隨機(jī)引物將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA； 通過DNA聚合酶I，RNase H，dNTP和緩沖液合成第二鏈cDNA； 用QiaQuick PCR提取試劑盒(Qiagen，荷蘭)純化cDNA片段，黏性末端修復(fù)，添加poly(A)，并連接測序接頭。通過瓊脂糖凝膠電泳選擇連接產(chǎn)物的大小，PCR擴(kuò)增，委托廣州基迪奧生物科技有限公司使用Illumina Novaseq 6000進(jìn)行測序。

1.2.3 差異表達(dá)基因 qRT-PCR 驗(yàn)證 測序獲得的原始序列去除低質(zhì)量序列得到Clean reads。使用對比軟件bowtie2將測序數(shù)據(jù)與枯草芽孢桿菌ASM211716V1菌株的基因組進(jìn)行mapping(Langmeadetal., 2012)，mapping后的枯草芽孢桿菌reads剔除掉，將所有油茶樣本剩余的reads進(jìn)行混合組裝，得到油茶的參考序列信息。然后，使用序列聚類軟件 TGICL 做進(jìn)一步序列拼接和去冗余處理(Perteaetal., 2003)，得到Unigene。FPKM (fragments per kilobases per millionreads)值用于評估每個(gè)基因的表達(dá)水平。差異表達(dá)基因的篩選條件為P-adjust<0.05 且∣log2FC∣>=1。采用 NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO 和 KEGG 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋。通過 GO 和 KEGG 富集分析，確定差異表達(dá)基因主要富集的通路及其可能的生物學(xué)功能。

1.2.4 差異表達(dá)基因 qRT-PCR 驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-Seq 數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行 qRT-PCR表達(dá)量驗(yàn)證。利用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參基因選用EF1α，引物列表見表1，隨后采用 ABI 7000 系統(tǒng)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和分析。每個(gè)基因設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同侵染時(shí)間點(diǎn)差異基因相對表達(dá)量。

表1 差異表達(dá)基因 qRT-PCR 驗(yàn)證使用的引物Tab.1 Primers used for qRT-PCR gene expression analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

油茶和內(nèi)生細(xì)菌互作的文庫0 (不接種對照)、6 、12 、24 h共產(chǎn)生序列52 958 922條，約46.1 Gb數(shù)據(jù)，差異表達(dá)基因12 561條，GC含量變化為43.14%～44.47%。過濾后Q30比例為91.94%以上。組裝的Unigene序列N50為1 175，Unigene平均長度為866 bp，數(shù)據(jù)的比對率為71.13%。通過blastx將Unigene序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫nr、SwissProt、KEGG 和 COG/KOG(evalue<0.000 01)發(fā)現(xiàn)有67 700獲得了注釋(44.5%)(表2)。對樣品的生物學(xué)重復(fù)和樣品組間的差異表達(dá)情況進(jìn)行評估，相關(guān)系數(shù)均大于0.8，這表明重復(fù)樣品間的相關(guān)性較強(qiáng)。

表2 內(nèi)生細(xì)菌接種油茶不同時(shí)間點(diǎn)油茶轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)Tab.2 Summary of De novo data generated for C. oleifera transcriptomes inoculated with endophytic bacteria at different time points

2.2 差異表達(dá)基因分析

通過對轉(zhuǎn)錄組測序后的基因進(jìn)行注釋和表達(dá)量(RPKM 值)計(jì)算可知，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有相同差異表達(dá)基因84個(gè)，內(nèi)生菌接種油茶根部6 h時(shí)的差異表達(dá)基因數(shù)量最多為5 715個(gè)，其次為24 h，差異表達(dá)基因數(shù)量為1 871個(gè)(圖1)。

圖1 3個(gè)不同侵染時(shí)間點(diǎn)的油茶差異表達(dá)基因分析Fig. 1 DEGs of three different infection time points of C. oleiferaA： 不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)差異； B： 特異差異基因和共有差異基因的維恩圖分析。 A： Differences in gene expression at different time points； B： Venn diagrams representing the numbers of DEGs and the overlaps of sets obtained across four comparisons.

2.3 差異表達(dá)基因的 GO 富集分析

以 correctedP-value ≤0.05 為篩選閾值，對不同時(shí)間獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行 GO 注釋分析，這些差異表達(dá)基因被富集注釋到3個(gè) GO 分類，分別是分子功能(molecular function)、細(xì)胞組成(cellular component)、生物過程 (biological process)。差異表達(dá)基因生物學(xué)過程中有2 188 個(gè)差異表達(dá)基因；細(xì)胞組分有3 489 個(gè)； 分子功能有2 490 個(gè)。

由圖2可知，油茶根系接種內(nèi)生細(xì)菌6 h時(shí)生物學(xué)過程中磷酸代謝途徑、含磷化合物代謝途徑、響應(yīng)激素途徑、茉莉酸代謝途徑、響應(yīng)細(xì)菌途徑等得到富集，這些途徑均與植物響應(yīng)細(xì)菌刺激有關(guān)； 分子功能中的萜烯合酶活性，雙加氧酶活性等得到富集； 細(xì)胞組分中膜、膜固有成分等得到富集。接種12 h時(shí),富集的生物學(xué)過程主要有單個(gè)有機(jī)體代謝過程、小分子代謝過程、羧酸代謝過程、酮酸代謝過程、有機(jī)酸代謝過程； 富集的分子功能主要有氧化還原酶活性、四吡咯綁定等； 富集的細(xì)胞組成有膜結(jié)合細(xì)胞器、胞內(nèi)膜細(xì)胞器等。接種24 h時(shí)，代謝途徑、單有機(jī)體代謝途徑、小分子代謝途徑等生物學(xué)過程得到富集； 富集的分子功能主要有催化活性； 細(xì)胞組分中膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞等得到富集(圖2)。

由GO富集分析中可知，油茶根系接種枯草芽孢桿菌1-L-29gfpr6 h后，生物學(xué)過程分子功能變化最明顯。

圖2 油茶-內(nèi)生細(xì)菌互作早期差異表達(dá)基因GO富集分析Fig. 2 GO enrichment analysis of DEGs at early stage of C. olefolia-endophytic bacteria

2.4 差異表達(dá)基因的 KEGG 代謝通路富集分析

對不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG pathways富集分析表明： 差異表達(dá)基因被富集到碳水化合物代謝、氨基酸代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境適應(yīng)性等通路。

油茶根系接種內(nèi)生細(xì)菌1-L-29gfpr6 h，植物-病原互作通路、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號途徑、芪類化合物、二芳基庚烷類化合物及姜辣素生物合成通路都有一定程度的提高，這些途徑均參與植物對病原菌的響應(yīng)。接種12 h，玉米素生物合成、核黃素代謝、雙萜生物合成有一定程度的提高。接種24 h，酪氨酸代謝、硫代謝等有一定程度的提高。這些代謝途徑可能參與植物與內(nèi)生菌的互作(圖3)。由此可見，互作過程中6 h 富集的代謝通路與12 h 和24 h的差別較大。

圖3 油茶-內(nèi)生細(xì)菌互作早期差異表達(dá)基因的 KEGG 富集分析Fig. 3 KEGG enrichment analysis of DEGs at early stage of C. olefolia-endophytic bacteria

2.5 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異基因

調(diào)節(jié)植物激素水平是內(nèi)生細(xì)菌重要的特點(diǎn)之一。在內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物互作過程中生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸等植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因均發(fā)生變化(Pinskietal.， 2019)。本研究中植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑差異表達(dá)基因占總差異表達(dá)基因的比例隨時(shí)間遞減，6 、12 、24 h分別為6.41%、 3.96%、1.98%。由圖4A和表3可知，生長素響應(yīng)基因(SAUR15/32/50)、生長素早期響應(yīng)基因(IAA)表達(dá)量在6 h或12 h都有一定程度的提高，表明內(nèi)生細(xì)菌1-L-29gfpr在一定程度可以刺激油茶根系的生長。木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解蛋白酶基因(XTH22/23/25)、TIFY家族基因(TIFY9/10B)、轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF(ERF1B)表達(dá)量在6 h顯著上調(diào)隨后下降。轉(zhuǎn)錄因子PIF(PIF3)、轉(zhuǎn)錄因子bZIP、DELLA蛋白編碼基因(GAI)表達(dá)量呈現(xiàn)低-高-低的狀態(tài)，在12 h最大。生長素響應(yīng)蛋白編碼基因(GH3.1)表達(dá)量則在24 h達(dá)到最大值。

2.6 植物病原互作相關(guān)差異基因

油茶根部接種內(nèi)生細(xì)菌1-L-29gfpr后，植物病原互作通路檢測到差異基因100個(gè)，其差異基因占總差異基因比例6、12、24 h分別為9.61%、3.96%、3.06%。油茶根部多個(gè)參與植物病原互作的基因均有上調(diào)，但到達(dá)峰值時(shí)間不同。由圖4B和表4可知，鈣調(diào)蛋白編碼基因(CAM2)、呼吸爆發(fā)氧化酶同源基因(RBOH)以及RPM1互作蛋白編碼基因(RIN4)表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值，隨后一直下降。轉(zhuǎn)錄因子MYB、MAPK激酶(NTF4)表達(dá)量呈現(xiàn)高-低-高的狀態(tài)，在12 h達(dá)到最低值。抗病蛋白相關(guān)基因(RPM1、RPS5)表達(dá)量則在12 h達(dá)到最大值。由此可見，內(nèi)生菌接種12 h后植物啟動抗病蛋白相關(guān)基因，LysM類受體激酶基因(CERK1)則持續(xù)性的下調(diào)。

2.7 苯丙素生物合成相關(guān)差異基因

苯丙素參與植物對生物和非生物刺激的的反應(yīng)(Vogt， 2010)。接種內(nèi)生細(xì)菌后6 、12 、24 h，苯丙素生物合成途徑差異基因占總差異基因比例分別為5.74%、3.96%、2.52%。在接種內(nèi)生細(xì)菌后的不同時(shí)間點(diǎn)，檢測到差異基因51個(gè)，6 h上調(diào)基因35個(gè)，下調(diào)基因16個(gè)； 12 h上調(diào)基因33個(gè)，下調(diào)基因18個(gè)； 24 h上調(diào)基因21個(gè)，下調(diào)基因30個(gè)。由圖4C和表5可知，過氧化物酶基因(pod，PER5/44/58，PNC2)表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值。糖苷水解酶(BGLU12、AA7GT、BGLU11)表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值。肉桂醇脫氫酶(CAD1)表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值。其中，大部分的基因都參與羥基苯基木質(zhì)素、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素、紫丁香木基木質(zhì)素以及香豆素的合成。

2.8 差異表達(dá)基因 qRT-PCR 驗(yàn)證

qRT-PCR 結(jié)果表明，隨機(jī)挑取的 5個(gè)基因在不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)量變化與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的趨勢一致(圖5)，說明本次轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果可靠。

3 討論

3.1 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異基因

內(nèi)生菌或病原菌的定殖都可引起植物體內(nèi)激素的變化，植物響應(yīng)內(nèi)生菌或病原菌最為重要的是三類激素：水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)(Dominiketal., 2012)。本研究中植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑差異基因占總差異基因比例從6.41%下降到1.98%，水楊酸、茉莉酸途徑產(chǎn)生了變化，但乙烯未發(fā)生明顯變化。在JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，ZIM(TIFY)結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)JAZ蛋白與其共抑制因子NINJA相互作用，進(jìn)而共同抑制JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(段龍飛等， 2013)。本研究中JAZ編碼基因TIFY9、TIFY108在接種6 h表達(dá)量上升，隨后下降，這表明在內(nèi)生菌與植物互作開始階段JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制，12 h抑制解除。這與King等(2019)研究相似，接種內(nèi)生菌后JA的響應(yīng)會存在延時(shí)效應(yīng)。TGA 基因家族是 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族中十分重要的一組，它可與水楊酸信號途徑關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子 NPR1 相互作用，促進(jìn) TGA 對下游PR1啟動子的結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)，提高植株抗病性(Johnsonetal., 2003)。本研究中TGA表達(dá)量在接種6 h時(shí)下降，但24 h時(shí)PR1是有明顯的上調(diào)表達(dá)。由此可見，內(nèi)生菌接種后，油茶根部的水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)開始時(shí)受到抑制，但隨后抑制解除。這可能是由于內(nèi)生菌為了定殖成功，在定殖初期(6 h)迫使植物降低了免疫反應(yīng)，定殖成功后內(nèi)生菌解除了免疫抑制，從而提高了植物的免疫力，這也證明內(nèi)生菌可提高植物抗性。關(guān)于內(nèi)生菌是如何迫使植物降低免疫反應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。

圖4 差異基因表達(dá)熱圖Fig. 4 Heat map diagram of the expression levels of DEGsA： 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)差異基因表達(dá)熱圖； B： 植物病原互作相關(guān)差異基因表達(dá)熱圖； C： 苯丙素生物合成相關(guān)差異基因表達(dá)熱圖。A:Heat map diagram of the expression levels of DEGs which are involved in plant hormone signal transduction. B:Heat map diagram of the expression levels of DEGs which are involved in plant-pathogen interaction. C:Heat map diagram of theexpression levels of DEGs which are involved in plant phenylpropanoid biosynthesis.

圖5 qRT-PCR表達(dá)量分析和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的驗(yàn)證Fig. 5 Expression analysis of qRT-PCR and verification of transcriptome dataA： TCH4基因； B:RBOHC基因； C:POD基因； D:TIFY基因； E:XTH基因。 A： TCH4 gene； B:RBOHC gene； C:POD gene； D:TIFY gene； E:XTH gene.

表3 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路差異基因Tab.3 DEGs of plant hormone signal transduction pathway

內(nèi)生細(xì)菌通過調(diào)控植物激素信號傳遞，起到促進(jìn)植物生長的作用(Straubetal., 2013)。赤霉素(GA)在植物株高等生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用(張佳琦等， 2019)。GA 信號通路中的關(guān)鍵組分 DELLA 蛋白，主要起阻遏作用，GA可以解除DELLA 蛋白的阻遏作用。本研究中DELLA 蛋白基因表達(dá)量最后降低，表明內(nèi)生菌定殖后期可以促進(jìn)油茶生長。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，DELLA 蛋白基因表達(dá)量與JA的相關(guān)基因表達(dá)量呈現(xiàn)相反的變化趨勢，這與Yimer等(2018)的研究結(jié)果一致，即GA和JA之間存在對立關(guān)系。推測其原因可能是植物將DELLA 蛋白作為調(diào)節(jié)生長與防御之間平衡的手段之一。

本研究中，接種內(nèi)生細(xì)菌6 h后油茶根系生長素Aux/IAA基因表達(dá)量明顯上升，但隨后開始出現(xiàn)下降，這與Irizarry等(2018)研究結(jié)果相反，這可能是由于本研究選取的時(shí)間點(diǎn)為侵染前期，而Irizarry的研究選取的是接種10天后的樣品。

表4 植物病原互作通路差異基因Tab.4 DEGs of plant-pathogen interaction pathway

表5 苯丙素生物合成通路差異基因Tab.5 DEGs of phenylpropanoid biosynthesis pathway

3.2 植物病原互作相關(guān)差異基因

植物與微生物共同進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的免疫防衛(wèi)體系。該免疫防衛(wèi)體系的正常運(yùn)行保證了植物的正常生長。由于植物細(xì)胞可以通過先天免疫反應(yīng)對MAMPs進(jìn)行監(jiān)測及響應(yīng)(Machoetal., 2014)，因此內(nèi)生菌或病原菌的定殖都可引起植物的免疫反應(yīng)。Drogue等(2014)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生菌可以抑制更多與植物防御有關(guān)基因的表達(dá)。在本研究中，內(nèi)生菌在6 h引起了植物病原互作通路大量基因的表達(dá)，但在12 h表達(dá)量明顯下降，表明在內(nèi)生菌侵染的初期油茶起動了防御反應(yīng)，到后期防御反應(yīng)減弱，讓內(nèi)生菌更好的實(shí)現(xiàn)定殖。

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物與微生物互作相關(guān)基因的過程中起著重要的作用。已有研究證明WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與大量的植物-病原菌互作反應(yīng)(Banerjeeetal., 2015; Ishihamaetal., 2012; Pandeyetal., 2009; Ryuetal., 2006)，但是對于內(nèi)生菌與植物相互作用中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子知之甚少。本研究中油茶根系的WRKY22/24/27/29/33都在6 h表達(dá)量上調(diào)，隨后出現(xiàn)一定的下調(diào)。Jorge對有益真菌與擬南芥互作過程中WRKY基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的途徑不同，其中WRKY33是受茉莉酸調(diào)節(jié)，并且在24 h的表達(dá)量是下降的(Saenz-Mataetal., 2014)。

鈣是植物中PAMP觸發(fā)的免疫力重要信號(Yuanetal., 2017)。植物環(huán)核苷酸門控通道(CNGC)蛋白介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流是識別受體復(fù)合物與鈣離子依賴性免疫的一個(gè)重要關(guān)聯(lián)。Tian等(2019)研究表明，CNGC通道直接被BIK1磷酸化并響應(yīng)flg22激活PTI信號傳導(dǎo)途徑。本研究中，內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌也存在flg22，CNGC編碼基因表達(dá)量上調(diào)可能與此有關(guān)。同時(shí)本研究中油茶根系的鈣調(diào)蛋白基因(CAM2)在6 h上調(diào)明顯，主要是由于鈣調(diào)蛋白參與了植物免疫反應(yīng)(Singhetal., 2020)。

3.3 苯丙素生物合成相關(guān)差異基因

植物的苯丙素化合物在抵抗病原體侵襲中起重要作用。苯丙素合成途徑中的木質(zhì)素可以使細(xì)胞壁增厚，抵抗真菌侵染釘形成的壓力，同時(shí)木質(zhì)化的細(xì)胞壁可以減弱病原菌細(xì)胞壁降解酶的作用(Bechingeretal., 1999; Naoumkinaetal., 2010)。苯丙素合成途徑在病原菌與植物互作過程中變化較大，但內(nèi)生菌與植物互作中的研究報(bào)道較少。本研究中3個(gè)主要單元： 對羥基苯基(H)、愈創(chuàng)木脂(G)和丁香基(S)的基因表達(dá)量在接種6 h和12 h均有上調(diào)，而在24 h下調(diào)。王恒照等(2019)對促生菌B.pumilusLZP02接種后的水稻根部的研究發(fā)現(xiàn)，LZP02可提高苯丙素合成相關(guān)基因的表達(dá)。這一結(jié)果與本研究存在一定的差異，其主要原因是本研究為12 h與24 h的表達(dá)量比較，如果將24 h與未接種內(nèi)生菌的試驗(yàn)組比較，苯丙素合成基因的表達(dá)量仍為上升，同時(shí)Hong的取樣時(shí)間為促生菌接種48 h后，也與本研究存在一定不同。

豆香素是苯丙素合成途徑中另一類非常重要的植物次生代謝產(chǎn)物。香豆素是木質(zhì)素合成的前體，并且香豆素本身就是一種植物抗毒素，可以防止病蟲的侵害，同時(shí)豆香素還對植物根部微生物組的裝配起著重要的作用(Stringlisetal., 2018)。本研究中香豆素合成基因表達(dá)量也出現(xiàn)了相應(yīng)的變化，在12 h達(dá)到峰值，這表明油茶內(nèi)生細(xì)菌可通過調(diào)節(jié)宿主信號傳導(dǎo)，從而提高宿主對病原菌的抗性。

4 結(jié)論

對內(nèi)生細(xì)菌接種后不同時(shí)間點(diǎn)的油茶根部轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，得到12 561個(gè)差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因在6 h最多，主要集中在植物-病原互作通路、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素化合物等通路。其中htpG、鈣調(diào)蛋白基因(CAM2)、呼吸爆發(fā)氧化酶編碼基因(RBOH)、轉(zhuǎn)錄因子WRKY22、鈣調(diào)蛋白基因(CAM2)、木糖轉(zhuǎn)移酶基因(TCH4)、茉莉酸受體ZIM結(jié)構(gòu)域包含蛋白編碼基因(TIFY10B)、Aux/IAA基因IAA1、過氧化物酶編碼基因等上調(diào)顯著。接種后6 h差異表達(dá)基因最多，為互作的關(guān)鍵時(shí)間。