慢性牙周病齦溝液中MAPK 的變化水平及意義

呂維志

（北京市大興區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院口腔科 北京 100067）

牙菌斑中的微生物是引起慢性牙周炎的始動因子，首先引起牙齦出血，牙齦的炎癥，進(jìn)而引起牙周支持組織的感染性炎癥的一類疾病，嚴(yán)重的牙周炎可以起起較深的牙周袋形成、附著性喪失和牙槽骨質(zhì)的吸收進(jìn)一步加重，最后可導(dǎo)致牙松動和牙拔除。牙齦發(fā)炎時，由于牙齦的腫脹和增生使牙齦緣的邊緣向牙冠方向移動，使牙齦溝加深，但是牙齦結(jié)合上皮的位置并沒有向根方遷移，為假性牙周袋。而患慢性牙周炎時，牙齦的結(jié)合上皮向根方增殖，其冠方牙齦與牙面分離，使齦溝加深而形成牙周袋，這是真性牙周袋。當(dāng)然，臨床上的牙周袋常包含上述兩種情況，即牙周袋是由于牙齦緣向冠方移動以及溝底向根方延伸所形成的。牙周袋內(nèi)含有菌斑、牙石、齦溝液、唾液粘蛋白、脫落上皮和白細(xì)胞等。慢性牙周炎是臨床最常見的疾病之一，它的發(fā)生機(jī)制是由于宿主的免疫防御機(jī)制與微生物之間的相互作用造成的。這種相互作用通過炎性因子所介導(dǎo)，而其中MAPK 信號通路在介導(dǎo)炎性因子發(fā)生、發(fā)展中起到很重要的作用。

MAPK，是把信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核內(nèi)部的重要途徑之一。絲裂原活化蛋白激酶的簡稱，是一組能被細(xì)胞外的各種刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。 MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于所有真核細(xì)胞內(nèi)，這一通路將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，介導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，參與細(xì)胞增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等一系列生理過程，具有至關(guān)重要的作用。但目前對MAPK 在慢性牙周炎的發(fā)病機(jī)制中所起的作用觀點(diǎn)不一。本研究旨在檢測慢性牙周炎患者齦溝液中MAPK 的水平，以及牙周基礎(chǔ)治療對其的影響。

實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：牙周探針，超聲潔治器，超聲刮治器，手動刮治器，沖洗注射器，3%過氧化氫溶液，1%碘甘油，吸潮紙尖，電子天平，-70℃低溫冰箱，冷凍離心機(jī)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱。緩沖液全自動酶標(biāo)儀：人絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），ELLISA試劑盒。洗板機(jī)：加樣槍。微型混合器：移液器恒溫水浴箱。

1 實(shí)驗(yàn)對象

1.1 病例選擇

病例中慢性牙周炎的患者20 例，經(jīng)與患者溝通后，且得到患者同意。對慢性牙周炎患者進(jìn)行齦溝液的提取，同一患者、同一顆牙齒，選取牙周炎最嚴(yán)重的部位提取，并且記錄好該部位，經(jīng)牙周基礎(chǔ)后，也要從相同的部位提取齦溝液，以便于對照。牙周健康者20 例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

對照健康者：GI≤1，AL=0mm，PD≤3mm；慢性牙周炎組：GI＞1，AL≥3mm，PD≥4mm。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

有吸煙史、系統(tǒng)性疾病者，如糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、肺部疾病、多發(fā)性硬化、肥胖、細(xì)菌、病毒和真菌系統(tǒng)感染者；3 個月內(nèi)用過大量抗生素、糖皮質(zhì)激素、非甾類抗炎藥免疫調(diào)節(jié)劑或避孕藥者；女性妊娠及哺乳期等。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先篩選出符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者，然后進(jìn)行全口牙周檢查，記錄牙周各項(xiàng)指標(biāo)，拍攝全口曲面斷層片。提取待測牙的齦溝液。經(jīng)過牙周基礎(chǔ)治療后，用雙氧水沖洗牙周，牙周內(nèi)放碘甘油，口腔衛(wèi)生宣教。然后6～8 周定期復(fù)查，再次在同一位點(diǎn)提取齦溝液，治療第12 周后拍片。所有牙周基礎(chǔ)治療、檢測記錄及液體樣本的采集均應(yīng)由同一醫(yī)師完成,排除誤差。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

組1：20 例牙周健康對照者。

組2：20 例慢性牙周炎患者。

組3：組2 中20 例慢性牙周炎患者進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療后（齦上潔治及齦下刮治）。

2 齦溝液樣本的采集和保存方法

2.1 各組提取齦溝液的要求

組1 要確保足夠的量，GCF 從沒有炎癥的多位點(diǎn)收集。

組2 提取齦溝液的部位是口腔中牙周炎最嚴(yán)重的位點(diǎn)（附著喪失最嚴(yán)重的位點(diǎn)）。

組3 提取齦溝液的部位與組2 相同且在治療后6～8 周收集。

2.2 EP 管準(zhǔn)備

0.5mlEP 管經(jīng)過高溫高壓消毒后，吸潮紙尖也要經(jīng)過物理（紫外線）消毒，把吸潮紙尖的尖端剪掉，裝在一個EP 管中，在電子天平上稱重并記錄。稱重后的重量減去收集齦溝液前記錄的重量，按比重?fù)Q算成齦溝液的體積。

2.3 待測牙準(zhǔn)備

三用氣槍吹干待測牙面和周圍牙齦黏膜約10秒，然后用棉球隔濕，此過程一直保持干燥，不能有水。

2.4 標(biāo)本取樣

將消過毒的吸潮紙尖輕緩慢慢放入待測牙的B側(cè)和L 側(cè)的近中、中央、遠(yuǎn)中6 個點(diǎn)位，遇到阻力即停止，在每個點(diǎn)位約停留30s 后取出，馬上將吸潮紙尖放入EP 管內(nèi)，如果取齦溝液時，吸潮紙尖帶血、食物殘?jiān)?、上皮壞死脫落組織等，則丟之不用，再重新取。

2.5 保存樣本

超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3 齦溝液中MAPK 的檢測

3.1 檢測方法

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對齦溝液中MAPK 水平進(jìn)行測量。ELISA 法定量可測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)血清或其它相關(guān)的生物液體中的MAPK 含量。

3.2 操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時均需混勻，混勻時盡量避免起泡，每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

4 結(jié)果

4.1MAPK 的濃度

患有牙周炎組，治療前齦溝液中MAPK 的平均水平是：191.68pg/ml；治療后齦溝液中MAPK 的平均水平是148.85pg/ml；健康對照組中MAPK 的平均水平是：139.40pg/ml。牙周炎治療前MAPK 明顯高于治療后，治療前牙周炎組MAPK 明顯高于健康對照組MAPK，治療后牙周炎組MAPK 與健康對照組無明顯差異，說明牙周炎通過牙周基礎(chǔ)治療后，齦溝液中MAPK 的濃度明顯下降了。

Tab1 健康對照牙齦齦溝液中和慢性牙周炎治療前MAPK 的比較

Tab2 慢性牙周炎治療前和治療后牙齦齦溝液中MAPK 的比較

Tab3 健康對照牙齦齦溝液中和慢性牙周炎治療后MAPK 的比較

4.2 臨床指標(biāo)的變化

牙周炎組治療前，GI、PD、AL、BI 均明顯高于健康對照組，治療后的GI、PD、AL、BI 又明顯低于治療前，從側(cè)面也證實(shí)了經(jīng)過牙周治療后，牙周炎的牙周情況已經(jīng)明顯改善了。

Tab4 牙周炎組治療前和健康對照組臨床指標(biāo)比較

Tab5 牙周炎組治療前和治療后臨床指標(biāo)比較

5 討論

牙周炎是多因素參與的疾病，宿主對細(xì)菌挑戰(zhàn)的免疫應(yīng)答反應(yīng)是決定牙周炎是否發(fā)生，以及病情的輕重、范圍的大小、發(fā)展速度的快慢等必要因素之一。全身性疾患也可以對牙周炎有消極影響，如慢性糖尿病、Down 綜合征和白細(xì)胞異常功能等。再或者有一些環(huán)境和行為因素也將是危險因素，譬如精神壓力和吸煙。為了了解影響牙周炎的因素，近年來不少人致力于牙周炎的研究。本實(shí)驗(yàn)，牙周炎的進(jìn)程，影響齦溝液中MAPK 的表達(dá)，從而成為確診牙周炎的指標(biāo)之一。

6 結(jié)論

6.1 慢性牙周炎經(jīng)基礎(chǔ)治療后，臨床指標(biāo)（GI、BI、PD、AL）都有顯著的變化，從側(cè)面證明牙周基礎(chǔ)治療是治療牙周疾病的方法之一。

6.2 牙周炎組的齦溝液中可以檢測到MAPK，并且濃度水平明顯高于健康對照組，說明MAPK 可能與牙周炎存在一定的正相關(guān)。

6.3 經(jīng)治療后，MAPK 的濃度水平明顯低于治療前。再次一次證明，牙周炎病情的嚴(yán)重程度影響著MAPK 的表達(dá)水平。

6.4 絕大多數(shù)患者經(jīng)過牙周基礎(chǔ)治療后，依從性較好，基本都按照正確的刷牙法，才能保持良好的口腔衛(wèi)生，從而為牙周炎后期的維護(hù)提供了可靠的保證。

6.5 齦溝液中MAPK 的濃度與探針深度、附著喪失，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在正相關(guān)關(guān)系。